JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

Published: October 19, 2018
doi:
10.3791/58580
, , ,
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University

Summary

بروتوكول مفصلة لتطبيق انقر فوق الكيمياء-وساعدت الاستراتيجية التقاط (كاريك) إينتيراكتومي الحمض النووي الريبي لتحديد البروتينات ملزما لكلا الترميز وفضله يرد الكشف.

Abstract

تعريف شامل للجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) هو المفتاح لفهم هذه الشبكة التنظيمية بوسترانسكريبشونال في الخلايا. استراتيجية تستخدم على نطاق واسع لمكافحة الممارسات التجارية التقييدية التقاط يستغل بوليادينيليشن [poly(A)] للكشف المستهدف، الذي غالباً ما يحدث في حقيقية النواة مرناس ناضجة، ترك معظم البروتينات ملزمة من non-poly(A) الكشف مجهولي الهوية. هنا يمكننا وصف الإجراءات المفصلة لأسلوب تم الإبلاغ عنها مؤخرا وصف فوق الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي إينتيراكتومي التقاط (كريك)، التي تمكن التقاط الترنسكربيتوم على نطاق المنظومة للممارسات التجارية التقييدية poly(A) و non-poly(A) من خلال الجمع بين العلامات الاستقلابية من الكشف، في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط، ووضع علامات على بيورثوجونال.

Introduction

يتم نسخها الجينوم البشري إلى أنواع شتى من الترميز وفضله الكشف (نكرناس)، بما في ذلك مرناس، ررناس، ترنس والكشف النووية الصغيرة (سنرناس) والكشف النوية الصغيرة (سنورناس) والكشف (لنكرناس) منذ فترة طويلة غير الترميز1. معظم هذه الكشف تمتلك ملابس للممارسات التجارية التقييدية وتعمل ك جسيمات (رنبس) ريبونوكليوبروتين2. ولذلك، تعريفاً شاملا للممارسات التجارية التقييدية شرط أساسي لفهم الشبكة التنظيمية بين الكشف والممارسات التجارية التقييدية، الذي تورط في مختلف الأمراض البشرية3،،من45.

وقد شهدت الأعوام القليلة الماضية دفعة كبيرة للممارسات التجارية التقييدية التي اكتشفت في مختلف نظم حقيقية النواة2،6، بما في ذلك الإنسان7،،من89،10،11، ماوس12،،من1314، الخميرة9،،من1516، الزرد17، melanogaster المورفولوجية18،19 ، ايليجانس كاينورهابديتيس16، و أعطيت التمويل20،،من2122، والطفيليات البشرية23،24،25 . وقد سهل هذه السلف باستراتيجية القبض على الممارسات التجارية التقييدية وضعتها كاستيللو et al. 7 وبالتز et al. 8 في عام 2012، الذي يجمع في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط من الجيش الملكي النيبالي والبروتينات المتفاعلة، والتقاط oligo(dT) من poly(A) الكشف، والطيف الكتلي (مللي ثانية)-على أساس البروتين التنميط. ومع ذلك، نظراً لحقيقة أن poly(A) معظمها موجود في مرناس الناضجة، التي تمثل لفقط ~ 3%-5% من التوكسينات الترنسكربيتوم26، هذه الاستراتيجية المستخدمة على نطاق واسع ليست قادرة على التقاط التفاعل مع non-poly(A) الكشف، بما في ذلك نكرناس معظم الممارسات التجارية التقييدية وقبل مرناس.

هنا، نحن تقرير الإجراءات المفصلة لاستراتيجية وضعت مؤخرا لإلقاء القبض على الترنسكربيتوم على نطاق المنظومة ل الممارسات التجارية التقييدية poly(A) و non-poly(A)27. ووصف كريك، يجمع هذه الاستراتيجية في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط ووسم الأيضية للكشف مع فوتواكتيفاتابل و “نقر” نوكليوزيد النظير (والتي تحتوي على مجموعة وظيفية بيورثوجونال التي يمكنها المشاركة في رد فوق)، 4- ثيوريديني (4SU)، و 5-اثينيلوريديني (الاتحاد الأوروبي). الخطوات الأساسية للحصول على نتائج مثالية مع استراتيجية كريك هي وسم الأيضية الفعالة والرد العابرة للربط، وانقر فوق الأشعة فوق البنفسجية، والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. لأن Cu(I) يستخدم المحفز في انقر فوق رد فعل يمكن أن يسبب تجزئة الكشف، ضروري يجند Cu(I) التي يمكن أن تقلل من تفتيت الحمض النووي الريبي. ونحن تصف كيفية تنفيذ ردود فعالة انقر في الخلية ليساتيس دون التسبب في تدهور حاد في الجيش الملكي النيبالي.

على الرغم من أن القبض على الممارسات التجارية التقييدية وتحديد الهوية في خلايا هيلا فقط هي المبينة في هذا البروتوكول، يمكن تطبيق هذه الاستراتيجية كريك لمختلف أنواع الخلايا وربما للكائنات الحية. وإلى جانب الاستيلاء على الممارسات التجارية التقييدية، يوفر هذا البروتوكول أيضا تبسيط الإجراءات خطوة بخطوة لإعداد نموذج MS وتحديد البروتين، والتقدير الكمي، التي يمكن أن تكون مفيدة لأولئك الذين ليسوا على دراية بتجارب البروتين.

Protocol

تنبيه: عند الاقتضاء، والكواشف المستخدمة ينبغي شراؤها في شكل رناسي خالية، أو حله في رناسي-مجاناً، المذيبات (لمعظم الحالات، في بيروكاربوناتي إثيل (ديبك)-المياه المعالجة). عند التعامل مع عينات الحمض النووي الريبي وخالية من رناسي الكواشف، دائماً ارتداء القفازات والأقنعة، وتغييرها متكرر لتجن…

Representative Results

وترد نتائج تمثيلية لخطوات مراقبة الجودة. وتشمل النتائج الأرقام لتحليل fluorescence في جل الموضحة في الخطوة 2.3.2 (الشكل 1)، وتحليل لطخة غربية الموضحة في الخطوة 4.1.3 (الشكل 2A)، وتحليل الفضة تلطيخ الموضحة في الخطوة 4-2-2 (الشكل 2). خطوات مر…

Discussion

الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي عادلة أحد مفاتيح نجاح تجارب كريك. بمناسبة يغاندس Cu(I) وعملية متأنية، تدهور الجيش الملكي النيبالي يمكن إلى حد كبير تخفيض، على الرغم من أن تم ملاحظة انخفاض جزئي. أن نسب الاستبدال من الاتحاد الأوروبي و 4SU في العينات التجريبية هي 1.18% و 0.46 في المائة، على التوا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين منح 91753206، 21425204، و 21521003 و “البحوث الرئيسية الوطنية” و “مشروع تنمية” 2016YFA0501500.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).

Tags

RNA-binding ProteinsCARICClick ChemistryRNA-interactome CapturePost-transcriptional Gene RegulationMRNANon-coding RNAHeLa CellsEU4SUUV Cross-linkingCell LysisRNA-protein Interaction
check_url/58580?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image