Cómo cuantificar la fracción de proteínas fluorescentes fotoactivado a granel y en células vivas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que implica genéticamente acoplado espectralmente distinto photoactivatable y proteínas fluorescentes. Estas quimeras de la proteína fluorescente permiten la cuantificación de la fracción PA-FP que es fotoactivado a ser fluorescentes, es decir, la eficacia de la fotoactivación. El protocolo revela que diversos modos de fotoactivación rendimiento fotoactivación diferentes eficiencias.
Abstract
Photoactivatable y – proteínas fluorescentes convertibles (PA-FPs) se han utilizado en microscopía de fluorescencia células vivas para el análisis de la dinámica de las células y conjuntos de proteínas. Hasta ahora, ningún método ha estado disponible para cuantificar a granel y en vivo las células expresan cuántos de los PA-FPs son fotoactivado a fluorescencia.
Aquí, presentamos un protocolo de reglas internas, es decir, genéticamente acoplado espectralmente distintos (photoactivatable) proteínas fluorescentes, a ratiometrically cuantificar la fracción de FPs PA todas expresadas en una célula que se encienden al ser fluorescente. Mediante este protocolo, se muestra que diferentes modos de fotoactivación rindieron fotoactivación diferentes eficiencias. Fotoactivación de alta potencia corta con un láser confocal de barrido microscopio (CLSM) dio lugar a hasta cuatro veces inferior fotoactivación eficacia que cientos de exposiciones de bajo nivel aplicadas por CLSM o un pulso corto aplicado por iluminación de campo amplio. Mientras que el protocolo ha sido ejemplificado aquí para GFP (PA-) y (PA) cereza, puede en principio ser aplicado a cualquier par de proteína fluorescente espectralmente distintos photoactivatable o photoconvertible y cualquier montaje experimental.
Introduction
En 2002, la primera photoactivatable términos generales aplicable (PA-GFP1) y photoconvertible (Kaede2) proteínas fluorescentes fueron descritas. Estas proteínas fluorescentes ópticos resaltador cambian sus propiedades espectrales sobre la irradiación con luz UV, es decir, se convierten en brillantes (proteínas fluorescentes photoactivatable, es decir, PA-FPs), o cambiar su color (photoconvertible FPs). Hasta la fecha, varios reversibles e irreversibles photoactivatable y photoconvertible proteínas fluorescentes han sido desarrolladas3,4. En estudios de conjunto o a granel, marcadores ópticos se han utilizado para estudiar la dinámica de proteínas o células enteras y la conectividad de los compartimentos subcelulares. Además, marcadores ópticos conectados una sola molécula base superresolution técnicas como Palma5 y FPALM6de imagen.
Aunque la fotoquímica procesos durante la fotoactivación o – conversión se han descrito muchos marcadores ópticos y estructuras cristalográficas incluso antes y después de la fotoactivación / – conversión se hicieron disponibles7 , 8, el mecanismofísico subyacente de foto de fotoactivación y – la conversión no se entiende totalmente. Además, hasta ahora sólo crudas estimaciones existen de la eficacia de fotoactivación y – conversión, es decir, la fracción de proteínas fluorescentes expresada que es realmente photoconverted o fotoactivado a ser fluorescente. In vitro los estudios ensemble han divulgado cuantificar el cambio en los espectros de absorción y la cantidad de nativos y activa la proteína en un gel9,10,11.
Aquí, presentamos un protocolo de quimeras de la proteína fluorescente para evaluar la fracción de proteínas fluorescentes fotoactivado a granel y en células vivas. Cuando se trabaja con proteínas fluorescentes genéticamente codificadas, la cantidad absoluta de proteínas expresadas varía de célula a célula y se desconoce. Si una célula expresando una FP PA muestra una señal más brillante después de la fotoactivación de otra célula, no puede ser distinguido si esta señal más brillante se debe a la mayor expresión de la PA-FP o una fotoactivación más eficiente de la PA-FP. Para estandarizar el nivel de expresión en las células, se introducen a reglas internas de genéticamente acopladas espectralmente distintas proteínas fluorescentes. Por el acoplador de la información genética de una proteína fluorescente de photoactivatable a un espectral distinta de proteínas fluorescentes, reglas internas se crean todavía se expresará en una cantidad total desconocida pero en una cantidad relativa fija y conocida de 1: 1 esta estrategia permite la caracterización cuantitativa de los diferentes esquemas de luz UV fotoactivación, es decir, la evaluación de la cantidad relativa de PA-FPs que puede ser fotoactivado con diferentes modos de fotoactivación y permite así Definir esquemas de fotoactivación que son más efectivos que otros. Además, esta estrategia permite en principio la evaluación de la cuantificación absoluta de la fracción de fotoactivado PA-FP. Para ello, es importante darse cuenta de que los estudios presentados de conjunto basada en la intensidad que hace que el análisis más complejo de lo dispuesto en el presente Protocolo. Parámetros de determinación de la medida intensidad fluorescente, brillo molecular es decir, diferentes, absorbancia y espectros de emisión y efectos de traste, necesitan ser considerados al comparar intensidades de fluorescencia de diferentes proteínas fluorescentes.
La cuantificación de basada en intensidad radiométrica presentados de fotoactivación eficiencia se ejemplifica para PA-GFP y PA-cereza en células vivas, pero en principio ampliamente aplicable y puede ser utilizada para cualquier proteína fluorescente photoactivatable bajo cualquier condición experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta ahora, ningún método existió para determinar a granel la fracción de PA-FPs expresada en células vivas que se fotoactiva ser fluorescente. El protocolo presentado puede utilizarse para cualquier par de proteína fluorescente espectralmente distintos. Si bien ejemplificados aquí por el irreversible FPs PA PA-GFP y PA-cereza, este enfoque es en principio aplicable a las proteínas de la photoconvertible así. La proteína fluorescente espectralmente distinta, sin embargo, debe seleccionarse cuidadosamente para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al laboratorio de Dorigo y el servicio de la proyección de imagen de Neurociencia en la escuela de medicina de la Universidad de Stanford para proporcionar espacio y equipo para este proyecto.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
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