यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण, biocytin वसूली और उच्च गुणवत्ता वाले पुनर्निर्माण हिप्पोकैम्पस CA2 न्यूरॉन्स में intracellular electrophysiological रिकॉर्डिंग के बाद का वर्णन करता है इन विट्रो, की अनुमति न्यूरॉन लक्षण वर्णन और अंततः ठीक ंयूरॉन शरीर रचना विज्ञान के लिए अध्ययन किया जाएगा ।
कैसे cortical नेटवर्क गतिविधि प्रक्रियाओं जानकारी बुनियादी और नैदानिक वैज्ञानिक सवालों की एक बड़ी संख्या के महत्व का है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल इस सर्किट के बुनियादी इमारत ब्लॉकों की पहचान करता है । cortical क्षेत्रों की गहराई से अध्ययन अंततः सर्किट घटकों की समझ के लिए आवश्यक के साथ अंय वैज्ञानिकों को प्रदान करेगा कैसे मस्तिष्क, प्रक्रियाओं और दुकानों जानकारी और क्या रोग में गलत हो जाता है, जबकि electrophysiological और रूपात्मक डेटा व्यापक रूप से मॉडल नेटवर्क है कि जानकारी के प्रसंस्करण का पता लगाने के निर्माण में गणना neuroscientists द्वारा प्रयोग किया जाता है । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि हिप्पोकैम्पस के CA2 क्षेत्र में रिकॉर्ड किए गए biocytin-भरे कक्षों को कैसे पुनर्प्राप्त किया जाता है और फिर 3d में खंगाला जाता है । इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन या पेप्टाइड सामग्री के प्रदर्शन में दर्ज की गई न्यूरॉन्स का वर्णन करता है ।
प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस ऐसी जटिलता की संरचना है कि ंयूरॉन उपप्रकार के वर्गीकरण1,2,3,4, उन दोनों के बीच कनेक्शन के नक्शे5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 और कैसे इस सर्किट संज्ञानात्मक कार्यों का समर्थन करता है12,13,14,15 अभी भी गहन अध्ययन के तहत कर रहे है और जारी बहस का विषय है । उदाहरण के लिए, विवरण और सर्किट की जटिलताओं को समझने के लिए और कई विभिंन अध्ययनों से प्राप्त डेटा समंवय करने के लिए, यह बहुत उपयोगी है परिभाषित करने के लिए और घटकों का वर्णन कर सकता है, लेकिन यह बहस के लिए एक बात बनी हुई है कि कितने अलग न्यूरॉन्स की कक्षाएं मौजूद हैं, या यहां तक कि क्या यह एक विशिष्ट वर्ग से संबंधित के रूप में सभी न्यूरॉन्स को परिभाषित करने के लिए संभव है. गणना उपकरण का निर्माण कर सकते है और जटिलता की डिग्री बदलती के साथ परीक्षण सर्किट16,17,18विकसित किया जा रहा है, लेकिन इन प्रयासों के लिए केंद्रीय सेल प्रकार के विस्तृत अध्ययन के लिए की जरूरत है और उन दोनों के बीच कनेक्शन के गुणों की । वयस्क चूहों के neocortex के स्थानीय सर्किट के बारे में जानकारी की एक बड़ी राशि पहले से ही यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकत्र किया गया है10,19,20,21, 22. हालांकि “तारों आरेख” पूरी तरह से दूर है, कुछ स्पष्ट पैटर्न या नियम उभरा है । इसके अलावा, हालांकि कुछ विवरण बदलती हैं, इन नियमों को दो स्तनधारी प्रजातियों (चूहे और बिल्ली) और कई neocortical क्षेत्रों में आम है, बुनियादी इमारत ब्लॉकों के विकास की अनुमति है कि समान रूप से मानव neocortex के लिए लागू होने की संभावना है । तकनीक यहां वर्णित presynaptic और postsynaptic क्षेत्रों है कि विस्तार में अध्ययन नहीं किया गया है में कनेक्शन में शामिल ंयूरॉंस की पहचान के द्वारा cortical सर्किट के कार्यात्मक नक्शे की हमारी समझ का विस्तार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, एक प्रोटोकॉल का उपयोग कि उत्कृष्ट ऊतक संरक्षण और उल्लेखनीय वयस्क मस्तिष्क ऊतक में धुंधला वसूली की अनुमति देता है । CA2 में स्थानीय सर्किट और इस उपक्षेत्र में न्यूरॉन की संपत्ति पर डेटा intracellular electrophysiological रिकॉर्डिंग के संयोजन के द्वारा इस विधि के साथ एकत्र किया गया है (तेज microelectrodes के साथ रिकॉर्डिंग युग्मित) biocytin भरने के साथ, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रियाओं और अत्यधिक विस्तृत ंयूरॉन पुनर्निर्माण, पड़ोसी CA क्षेत्रों के साथ प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति23,24,25।
इस लेख में वर्णित तकनीक विस्तृत न्यूरॉन्स कोशिकाओं के सही वर्गीकरण और उच्च गुणवत्ता और दोनों अपने वृक्ष और axonal arbors, डेटा है कि हो सकता है की सटीक पुनर्निर्माण की अनुमति प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है तेज इलेक्ट्रोड का उपयोग कर युग्मित रिकॉर्डिंग से एकत्र electrophysiological डेटा के साथ संबंधित. ऊतकवैज्ञानिक प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स की ultrastructure को संरक्षित करने और दोनों वृक्ष (spins सहित) और axonal arbors की उत्कृष्ट वसूली प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है. उदाहरण के लिए, एक निर्धारण समाधान में सबसे पहले विसर्जित करके दोहरे निर्धारण तकनीक के सिद्धांत और दूसरा आज़मियम tetroxide में फिक्सिंग के बाद प्रकाश सूक्ष्म26के लिए एक अच्छा विपरीत देता है । glutaraldehyde और picric एसिड समाधान की एक छोटी राशि के लिए एंटीबॉडी प्रवेश बढ़ाने और कोशिकाओं ultrastructure के रूप में एक पिछले अध्ययन में सुझाया27संरक्षित करने के लिए निर्धारण समाधान में जोड़ रहे हैं । permeabilization क्रायो-सुक्रोज के साथ सुरक्षा के साथ संयुक्त, बजाय एक पारंपरिक डिटर्जेंट, भी दर्ज की कोशिकाओं के विस्तृत रूपात्मक विश्लेषण के लिए ऊतकों के इष्टतम संरक्षण प्रदान करता है, फ्रीज-गल विधि का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क स्लाइसें । इसके अलावा, विशेष रूप से बहुत ठीक संरचनाओं के दृश्य पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने से सुधार हुआ है, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) और सोडियम borohydride (नभ4) के साथ गर्मी के साथ । निकेल क्लोराइड (NiCl2) सहिजन peroxidase (एचआरपी) प्रतिक्रिया को जोड़ने के लिए एक काला वर्णक प्रतिक्रिया उत्पाद प्राप्त करने के लिए भी इसके विपरीत बढ़ जाती है ।
निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए उत्कृष्ट ऊतक संरक्षण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं का वर्णन और अत्यधिक विस्तृत ंयूरॉंस 3 डी पुनर्निर्माण इन विट्रो मेंintracellular रिकॉर्डिंग के बाद । स्लाइस तैयारी का विवरण, intracellular युग्मित रिकॉर्डिंग तेज इलेक्ट्रोड और अनुवर्ती ऊतकवैज्ञानिक हमारी प्रयोगशाला में उपयोग की गई प्रक्रियाओं का उपयोग कर पहले28बताया गया है । हालांकि प्रोटोकॉल में biocytin के साथ intracellularly भरे कक्षों पर लागू होता है 450 – 500 माइक्रोन मोटे स्लाइस, पूरे सेल रिकॉर्डिंग के बाद एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है । हालांकि, पतले स्लाइस का उपयोग कोशिकाओं के कम पूर्ण पुनर्निर्माण में परिणाम होगा ।
इन विट्रो में Electrophysiological रिकॉर्डिंग (चित्रा 1 एसी,डी और ई. पू., डी) histochemical और immunohistochemical प्रक्रियाओं के साथ संयुक्त विस्तृत आकृति विज्ञान, कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन सामग्री सक्षम और पता चला कि दर्ज वयस्क cortical न्यूरॉन्स की पहचान. CA2 क्षेत्र में, इस तकनीक को पहली बार के लिए स्थानीय सर्किट के अध्ययन की अनुमति दी और न्यूरॉन्स कि पहले CA1 या CA3 में वर्णित नहीं किया गया था उपवर्गों का पता चला: वाइड वृक्ष और axonal आर्बर टोकरी कोशिकाओं (आंकड़ा 1b), bistratified कोशिकाओं और एसपी-एसआर न्यूरॉन्स ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल को न्यूरॉन्स के ultrastructure की रक्षा और दोनों वृक्ष (spins सहित) और axonal arbors की उत्कृष्ट वसूली प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है । महत्वपूर्ण कदम के लिए दोहरे निर्धारण तकनीक का उपयोग शामिल प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए कंट्रास्ट बढ़ाने के लिए26 और glutaraldehyde और picric एसिड समाधान के अलावा निर्धारण समाधान के लिए एंटीबॉडी पैठ बढ़ाने के लिए और ंयूरॉंस की रक्षा ultrastructure27. कोमल फ्रीज-गल permeabilization ठीक संरचना के बेहतर संरक्षण देता है, जबकि osmication और राल एंबेडिंग कम z-विमान सिकुड़ते28। इसके अलावा, बहुत ठीक संरचनाओं के दृश्य (उदाहरण के लिए छोटे बूटोंस के साथ ठीक axons) एच2हे2 और नभ4 के साथ वर्गों की पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के द्वारा सुधार हुआ है । इसके विपरीत भी एचआरपी प्रतिक्रिया करने के लिए NiCl2 के अलावा के साथ बढ़ाया जा सकता है ।
ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रिया यहां विस्तृत reproducibility और विश्वसनीयता के मामले में उत्कृष्ट परिणाम प्रदान करता है । हालांकि, electrophysiological रिकॉर्डिंग की अवधि आमतौर पर गरीब axonal धुंधला के साथ जुड़े छोटे रिकॉर्डिंग के साथ, biocytin/प्रतिदीप्ति धुंधला की गुणवत्ता का निर्धारण करेगा । रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल का चुनाव (intracellular रिकॉर्डिंग तेज इलेक्ट्रोड बनाम पूरे सेल पैच clamping का उपयोग कर) भी biocytin प्रतिधारण और ठीक शरीर रचना के संरक्षण को प्रभावित कर सकते हैं ।
जबकि ऊतकवैज्ञानिक प्रसंस्करण के दौरान ठीक संरचना के संरक्षण में कठिनाइयों का सामना करना पड़ा यहां वर्णित है और समय 100X आवर्धन पर पुनर्निर्माण के लिए लिया (1-axon की जटिलता के आधार पर 4weeks) की सराहना कर रहे हैं, इस विधि देता है एक वृक्ष और axonal व्यास का सटीक प्रतिनिधित्व । कम मांग प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए प्रकट biocytin-लेबलिंग समझ में आता है, तथापि, इन अक्सर ठीक axonal शाखाओं के बाधा स्पष्ट दृश्य । डिटर्जेंट, Avidin के प्रवेश को बढ़ावा देने के लिए-एचआरपी biocytin और एंटीबॉडी प्रकट करने के लिए, अक्सर मोटी वर्गों में आवश्यक हैं, लेकिन ठीक संरचना को बाधित कर सकते हैं । पुनर्निर्माण के semiautomatic तरीकों के लिए लगातार Neuroscientists खोज, लेकिन, अभी के लिए और axons के लिए विशेष रूप से, biocytin-एचआरपी मैनुअल पुनर्निर्माण के साथ सोने के मानक31रहता है ।
अत्यधिक विस्तृत ंयूरॉन पुनर्निर्माण, विशेष रूप से सटीक axonal बूटोंस और नोड्स के चित्र, उपस्थिति या myelin की अनुपस्थिति और अधिक आम तौर पर पूरा axonal आर्बर के ड्राइंग, इसके साथ सटीक axon व्यास परिवर्तन के प्रतिनिधित्व के साथ लंबाई, एक अलग प्रकार के ंयूरॉंस की सटीक पहचान के लिए और अधिक जानकारी प्रदान करते हैं । हालांकि कई न्यूरॉन्स बिल्कुल एक विशिष्ट वर्ग में फिट नहीं हो सकता है, ऊपर वर्णित तकनीक ंयूरॉन electrophysiological गुणों पर संबंधित डेटा प्रदान करता है, अल्पकालिक प्लास्टिक कनेक्शन के एक विशिष्ट प्रकार के साथ जुड़े और विस्तृत न्यूरॉन पुनर्निर्माण, तारों आरेख की अनुमति, CA2 क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, विस्तार में अध्ययन किया जाना.
ठीक है, विस्तृत संरचना अक्सर गणना मॉडल में सरलीकृत है । जबकि समझ में, यह जानकारी है कि भविष्य में महत्वपूर्ण साबित हो सकता है की हानि में यह परिणाम है । समानांतर synaptic डेटा के साथ विस्तृत 3 डी पुनर्निर्माण के विश्लेषण के लिए आगे के मानदंडों के अलावा की अनुमति देगा न्यूरॉन्स वर्गीकरण. डेटा सार्वजनिक खजाने में जमा किया जा सकता है और axon व्यास और कार्रवाई संभावित प्रोपेगेशन गणना पर myelination में छिटपुट बदलाव के परिणाम का पता लगाने के लिए मॉडलिंग द्वारा इस्तेमाल किया ।
The authors have nothing to disclose.
इस अनुसंधान नोवार्टिस फार्मा (बेसल) और चिकित्सा अनुसंधान परिषद के प्रोफेसर एलेक्स थॉमसन, जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC-BB/G008639/1), शारीरिक सोसायटी, यूरोपीय संघ के लिए संमानित किया से धन प्राप्त हुआ है क्षितिज २०२० विशिष्ट अनुदान समझौते no. ७२०२७० (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA1) के तहत अनुसंधान और नवाचार के लिए फ्रेमवर्क कार्यक्रम और विशिष्ट अनुदान समझौते no. ७८५९०७ (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA2) के अंतर्गत । हम बहुत अंय cortical क्षेत्रों में प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए प्रो एलेक्स थॉमसन के लिए आभारी हैं, धन की सुरक्षा और इस परियोजना के लिए उसे निरंतर समर्थन के लिए । प्रयोगशाला द्वारा किए गए योगदान-सदस्यों को जो वसूली प्रोटोकॉल और पुनर्निर्माण CA2 ंयूरॉंस में मदद की है आभार स्वीकार कर रहे हैं: जे Deuchars, एच Pawelzik, डी. आई. ह्यूजेस, ए. पी. Bannister, के. Eastlake, एच. Trigg, एन. ए. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |