ここで説明したプロトコルを記述する蛍光分析、biocytin 回復と海馬 ca 2 介在神経細胞内の電気生理学的記録in vitro での許可神経以下の質の高い復元特性と調査されるべき最終的に細かい神経解剖学。
どのようにプロセスを皮質ネットワーク活動情報基礎と臨床の科学的な質問の数が多いに重要です。ここで説明したプロトコルでは、この回路の基本的なビルディング ブロックを識別します。皮質領域の詳細な研究は最終的に回路部品と他の科学者脳の取得を理解するために必要なプロセス、情報と何がうまくいかない病気、生理中に格納を提供します。形態学的データは広く情報処理を探るモデル ネットワークの構築で計算神経科学者によって使用されます。ここで説明したプロトコルについて説明しますどのように海馬の ca 2 領域に記録された biocytin で満たされた細胞の回復し、3 D で再構築します。さらに、プロトコルは、カルシウム結合蛋白質またはペプチッド記録された介在ニューロンでコンテンツのデモをについて説明します。
皮質および海馬神経の分類5,6の1,2,3,4, その間の関係の地図をサブタイプなどの複雑な構造は、します。,7,8,9,10,11この回路が認知機能12,13,14,15をサポートする方法もなお強烈な研究と継続的な議論の主題が。たとえば、詳細と回路の複雑性を理解して、多くのさまざまな研究から得られたデータを調整するを定義し、コンポーネントを記述することができるため非常に便利だが、それはどのように議論のための問題のまま多くの異なったニューロンの存在、あるいはそれが特定のクラスに属するすべてのニューロンを定義することが可能かどうか。計算ツールを構築でき、複雑さの度合いと回路をテストされている開発16,17,18, が、これらの努力の中心は細胞の詳細な研究の必要性それらの間の接続のプロパティ。使用して既に収集されて大量ラットの大脳皮質の局所神経回路についてのプロトコルがここで説明した10,19,20,21,22.「配線図」は完成には程遠い、明確なパターンやルールが浮上しています。、異なるいくつかの詳細がこれらのルールは、2 つの哺乳類種 (ラットおよび猫)、そしていくつかの新皮質領域、一般的な人間の大脳新皮質に同様に適用できる可能性のある基本的なビルディング ブロックの開発が可能.ここで説明する手法が研究されていない前に、詳細にプロトコルを使用している領域での接続に関与するシナプス前及びシナプス後ニューロンを識別することによって皮質の機能地図の私達の理解を拡張する使用は大人の脳組織の優秀な組織の温存と顕著な染色の回復ができます。細胞内の電気生理学的記録 (鋭い電極と一対の録音) を充填、biocytin と組み合わせることでこの方法で収集された ca 2 の局所回路でこのサブフィールドにおける神経膜特性データ蛍光抗体法、組織プロシージャおよび非常に詳細な神経再建、隣接 CA 地域23,24,25との直接比較を許可します。
長年にわたり細胞と高品質の適切な分類と両方の樹状突起と軸索のアーバー、ことができるデータの正確な復元を許可する詳細な神経解剖学を取得するこの資料に記載されている技術を開発しました。鋭い電極を使用してペアのレコーディングから収集した電気生理学的データに関連付けられます。組織のプロトコルは、神経細胞の微細構造を保持し、樹状突起 (含む棘) と軸索のアーバーの優秀な回復を取得する最適化されています。たとえば、まず固定液に浸漬し、第二に四酸化オスミウムで固定後の二重固定法の原理は、光顕26の良いコントラストを与えます。少量のグルタルアルデヒドとピクリン酸のソリューションは、固定液抗体浸透を強化し、以前研究27で推奨されている細胞の微細構造を保持するに追加されます。従来の洗剤ではなく、ショ糖、低温保護と組み合わせて凍結融解法を用いた脳スライスの透過はまた記録された細胞の詳細な形態学的分析のためのティッシュの最適な保全を提供します。さらに、特に非常に微細構造の可視化が過酸化水素 (H2O2) と水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) 孵化と、背景の汚損を減らすことによって向上します。西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) に塩化ニッケル (NiCl2) を追加する黒色色素反応生成物を得る反応はまた、コントラストを向上させます。
次のプロトコルでは、優れた組織の温存と体外細胞内記録次の非常に詳細な神経 3 D 再構成を確認するための手順について説明します。スライス標本の説明を使用してペアの細胞内の録音の鋭い電極と私たちの研究室で使用される組織学的手順は、以前に報告された28をされています。450-500 μ m の厚さのスライスに biocytin 満ちている細胞内のセルに適用されますが、プロトコル、全体セルの録音に続く同じプロトコルを使用される可能性があります。ただし、薄いスライスの使用は、細胞の少ない完全な復元になります。
電気生理学的記録の in vitro (図 1 Ac、d 、紀元前 d) 併用組織化学的、免疫組織化学的手順詳細な形態、カルシウム結合タンパク質のコンテンツを有効にして明らかに大人の皮質介在ニューロンの id が記録されます。Ca 2 地域でこの手法は初めての局所神経回路の研究を許可し、CA1、CA3 でないが以前記載されていた介在のサブクラスを明らかに: 樹状突起・軸索の広いアーバー バスケット細胞 (図 1 b)解像細胞と SP SR 介在ニューロン。
ここで説明されているプロトコルは、神経細胞の微細構造を保持し、樹状突起 (含む棘) と軸索のアーバーの優秀な回復を取得する最適化されています。重要なステップなど光顕26のコントラストを高めるため二重固定法の使用抗体浸透を強化し、神経を保持する固定液に, グルタルアルデヒドおよびピクリン酸溶液添加微細構造の27。Osmication と樹脂埋め込み z 平面収縮28に削減、穏やかな凍結融解の透過は微細構造のより良い保全を提供します。また、H2O2と背景の汚損を抑える NaBH4セクションの孵化によって (たとえば小さなボタンと軸索の罰金) の微細構造の可視化が向上します。コントラストは、HRP 反応に NiCl2を追加して増やすことができます。
ここで詳細な病理組織学的のプロシージャでは、再現性と信頼性の面で優れた結果を提供しています。ただし、電気生理学的記録の期間は biocytin/蛍光染色、貧しい軸索染色に通常関連付けられている短い録音の品質を決定します。微細解剖学の biocytin 保存/保護プロトコル (全細胞パッチク対鋭い電極を用いた細胞内記録) を記録する選択も影響します。
感謝は、ここで説明した組織学的処理と 100 倍の倍率 (軸索の複雑さによっては 1-4 週間) で再構築するのにかかる時間の間に微細構造を維持する、このメソッドにより、困難に遭遇しながら、樹状突起と軸索直径の正確な表現です。ただし、これらはしばしば微細軸索分岐の明確に可視化を妨げ、以下の biocytin ラベルを明らかにする要求の厳しいプロトコルの使用は理解できます。洗剤、アビジン-HRP biocytin と抗体を明らかにするためのエントリを促進するために、厚いセクションで必要が、微細構造を混乱させることができます。神経科学者検索、復興の半自動の方法の常が、今、マニュアル再建を特に biocytin HRP 軸索ゴールド スタンダード31のままです。
非常に詳細な神経再建、軸索の研究とノード、有無、ミエリンのそしてより一般的に沿って正確な軸索直径の表現で完全な軸索のアーバーの図面変更の特に正確な図面その長さ、さらに別個の interneurone の型を正確に識別のための情報を提供します。上記手法は、神経電気生理学的特性、接続の特定の種類に関連付けられているし、詳細な短期可塑性に相関のデータを提供しますが多く介在神経細胞は、特定のクラスと正確に合わない場合があります、神経再建、配線図、ca 2 地域でできるように詳細に検討します。
計算モデルの罰金、詳細な構造が簡素化されました。ながら理解できるが、この結果、将来的に重要かもしれない情報の損失。シナプスの並列データの詳細な 3 D 再構成の分析は介在神経細胞分類の基準さらに添加を可能にします。データは、公開リポジトリに堆積して計算軸索直径と活動電位伝搬の髄鞘形成の散発的な変化の結果を探検するモデラーのために使用できます。
The authors have nothing to disclose.
この研究はノバルティス ファーマ (バーゼル) と授与教授アレックス ・ トムソン、バイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 (BBSRC-BB/G008639/1)、日本生理学会、欧州連合の医学研究議会から資金を受けています。ホライズン 2020年枠組み計画研究・革新特定無償契約第 720270 の下で (人間の脳プロジェクト SGA1) と特定無償契約第 785907 の下で (人間の脳プロジェクト SGA2)。非常に感謝しております教授アレックス ・ トムソンに彼女の継続的な支援、資金調達、その他の皮質でプロトコルを設定するためこのプロジェクトのため。研究室のメンバーを回復プロトコルの最適化を助け、CA2 神経細胞を再構築による貢献は感謝し: j. Deuchars、h. Pawelzik、d. i. ヒューズ、a. p. バニスター、k. イーストレーク、H. トリッグ、N. A. Botcher。
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |