Detta manuskript beskrivs syntesen av en enkel vägg nanorör (SWCNT)-konjugerat MALAT1 antisense gapmer DNA oligonukleotiden (SWCNT-anti-MALAT1), vilket visar SWCNT pålitlig leverans och den potenta terapeutiska effekten av anti-MALAT1 in vitro- och in vivo. Metoder som används för syntes, modifiering, konjugation, och injektion av SWCNT-anti-MALAT1 beskrivs.
Den enkel vägg nanorör (SWCNT) är en ny typ av nanopartiklar, som har använts för att leverera flera typer av läkemedel in celler, till exempel proteiner, oligonukleotider och syntetiska småmolekylär droger. SWCNT har anpassningsbara dimensioner, en stor yta vid ytliga och flexibelt kan binda med droger genom olika modifieringar på dess yta. Därför är det ett idealiskt system att transportera narkotika in i celler. Långa icke-kodande RNAs (lncRNAs) är ett kluster av icke-kodande RNA längre än 200 nt, som inte kan översättas till protein men spelar en viktig roll i biologiska och patofysiologiska processer. Metastaser-associerade lunga adenokarcinom avskrift 1 (MALAT1) är en mycket lncRNA. Det visades att högre MALAT1 nivåer är relaterade till den dåliga prognosen av olika cancerformer, inklusive multipelt myelom (MM). Vi har visat att MALAT1 reglerar DNA reparation och cell död MM; MALAT1 kan således betraktas som ett terapeutiskt mål för MM. Effektiv leverans av den antisense oligo till hämma/knockdown MALAT1 in vivo är dock fortfarande ett problem. I denna studie vi ändra SWCNT med PEG-2000 och konjugat en anti-MALAT1 oligo till det, testa leveransen av denna förening in vitro-, injicera det intravenöst i en disseminerad MM musmodell och iaktta en signifikant hämning av MM progression, vilket indikerar det SWCNT är en perfekt leverans shuttle för anti-MALAT1 gapmer DNA.
SWCNT är en roman nanomaterial som kan leverera olika typer av läkemedel, såsom proteiner, små molekyler och nukleinsyror, stabilt och effektivt med perfekt tolerabilitet och minsta toxicitet i vitro1 och invivo2. En functionalized SWCNT har utmärkt biokompatibilitet och vatten löslighet, kan användas som en transfer för mindre molekyler och kan bära dem för att penetrera cellmembranet3,4,5.
lncRNAs är ett kluster av RNA (> 200 nt) som transkriberas från genomet till mRNA men kan inte översättas till proteiner. Ökande bevis har visat att lncRNAs delta i regleringen av gen uttryck6 och är involverade i initiering och progression av de flesta typer av cancer, inklusive MM7,8,9. MALAT1 är en kärn-berikat kodande utskrift 2 (NEAT2) och en mycket lncRNA10. MALAT1 redovisas initialt i metastaserande icke-småcellig lung cancer (NSCLC)11, men har varit i ökad utsträckning i många tumörer5,12,13. Det är en av de mest högt uttryckt lncRNAs och korreleras med en dålig prognos i MM8,14. Uttrycket är MALAT1 betydligt högre i dödlig kurs extramedullär MM patienter jämfört med dem som endast diagnostiserats som MM15.
I en tidigare studie, vi har bekräftat att anti-MALAT1 oligos kraftfullt leda till DNA-skador och apoptos i MM16 med hjälp av gapmer DNA antisense oligonukleotider inriktning MALAT1 (anti-MALAT1) i MM celler. Gapmer DNA är sammansatt av antisense DNA och kopplat av 2′-OMe-RNAs, vilket kan snabba MALAT1 klyvning av RNase H aktivitet en gång bunden17. Invivo leverans effektiviteten i antisense oligos begränsar fortfarande dess kliniska användning.
För att testa leverans effekten av SWCNT för anti-MALAT1 gapmer oligos, den anti-MALAT1 gapmer DNA är konjugerat till DSPE-PEG2000-Amin functionalized SWCNT. Den SWCNT-anti-MALAT1 är sedan injiceras intravenöst i en MM disseminerad musmodell; en slående hämning observeras efter fyra behandlingar.
Fynd har visat att lncRNAs delta i regleringen av många fysiologiska och patofysiologiska förfaranden i cancer, inklusive MM7,8,9. de har potential att vara måltavlan för cancerbehandling, som kan förverkligas genom antisense oligonukleotider20,21,22. US Food and Drug Administration (FDA) har godkänt flera antisense oligonukleotid…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tacka Lerner Research Institute proteomiska, genomisk, och imaging kärnor för deras hjälp och stöd. Finansiering: Detta arbete stöddes ekonomiskt av NIH/NCI grant R00 CA172292 (till J.J.Z.) och nystartade fonder (till J.J.Z.) och klinisk och translationell vetenskap Collaborative (CTSC) fall Western Reserve University Core Utilization Pilot bidrag (till J.J.Z.). Detta arbete utnyttjas mikroskopet Leica SP8 confocal som köpts med finansiering från nationella institut för hälsa SIG grant 1S10OD019972-01.
SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT – 3’ | |
MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC – 3’ | |
GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG – 3’ | |
GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG – 3’ | |
Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
SPSS software | IBM | version 24.0 | |
D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |