Photobleaching Cyanobacterium Prochlorococcus में FtsZ रिंग के सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करता है
Summary
यहाँ हम cyanobacteria के autofluorescence को कम करने के लिए एक photobleaching विधि का वर्णन करते हैं । photobleaching के बाद, stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी cyanobacterial FtsZ अंगूठी के तीन आयामी सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Abstract
सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से कई जीवों में प्रोटीन बातचीत और सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । संश्लेषक जीवों में, हालांकि, सुपर संकल्प इमेजिंग के पार्श्व संकल्प केवल ~ १०० एनएम है । कम संकल्प मुख्य रूप से उच्च तीव्रता पराबैंगनीकिरण है कि सुपर संकल्प इमेजिंग, जैसे stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के लिए आवश्यक है की वजह से संश्लेषक कोशिकाओं की उच्च autofluorescence पृष्ठभूमि के कारण है । यहां, हम एक photobleaching-सहायता स्टॉर्म विधि जो हाल ही में इमेजिंग समुद्री picocyanobacterium Prochlorococcusके लिए विकसित किया गया था का वर्णन । photobleaching के बाद, Prochlorococcus के autofluorescence प्रभावी ढंग से कम है ताकि तूफान ~ 10 एनएम के एक पार्श्व संकल्प के साथ किया जा सकता है । इस विधि का प्रयोग, हम vivo में तीन आयामी (3-डी) FtsZ प्रोटीन के संगठन का अधिग्रहण और Prochlorococcusके सेल चक्र के दौरान चार अलग FtsZ अंगूठी morphologies की विशेषता है । विधि हम यहां का वर्णन अंय संश्लेषक जीवों के सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए अपनाया जा सकता है ।
Introduction
सुपर संकल्प माइक्रोस्कोप्स प्रकाश की विवर्तन सीमा को तोड़ने और उप-विवर्तन प्रस्तावों (< २०० एनएम) के भीतर छवियों को प्रदान कर सकते हैं । वे कई जीवों में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है प्रोटीन स्थानीयकरण और सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन । प्रमुख सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी विधियों संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम), प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (STED), तूफान, और photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) शामिल हैं । तंत्र और इन सुपर संकल्प सूक्ष्मदर्शी के आवेदनों की समीक्षा की गई है कहीं और1,2।
तूफान के रूप में उच्च के रूप में एक संकल्प प्राप्त कर सकते है 10 स्थानिक जुदाई3,4द्वारा एनएम । तूफान के लिए, एक विवर्तन-सीमित क्षेत्र के भीतर केवल एक अणु (“पर”) सक्रिय है और अणुओं के बाकी निष्क्रिय रखा जाता है (“बंद”) । तेजी से स्विच का एक संचय करके-पर और एक अणुओं के बंद, एक “विवर्तन-असीमित” छवि उत्पंन किया जा सकता है3। इस बीच, कार्बनिक रंजक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कई प्रकार के तूफान में लागू होते हैं, नियमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी5,6के लिए एक आसान उन्नयन की अनुमति ।
तूफान व्यापक रूप से संश्लेषक कोशिकाओं में लागू नहीं किया गया है, जैसे cyanobacteria, शैवाल, और chloroplasts के साथ संयंत्र कोशिकाओं7,8, जो इस तथ्य के कारण है कि तूफान photoswitching ड्राइव करने के लिए उच्च लेजर तीव्रता की आवश्यकता है । उच्च तीव्रता लेजर प्रतिकूल संश्लेषक कोशिकाओं में मजबूत autofluorescence पृष्ठभूमि उत्तेजित और स्टॉर्म इमेजिंग में एकल अणु स्थानीयकरण के साथ हस्तक्षेप । आदेश में उपसेलुलर संरचनाओं या संश्लेषक कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए तूफान का उपयोग करने के लिए, हम पृष्ठभूमि autofluorescence9संकेतों को बुझाने के लिए एक photobleaching प्रोटोकॉल विकसित किया । एक नियमित immunofluorescent धुंधला प्रक्रिया में, नमूनों अवरुद्ध कदम है, जो संश्लेषक कोशिकाओं तूफान के लिए आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए autofluorescence को कम करती है के दौरान एक उच्च तीव्रता के सफेद प्रकाश को उजागर कर रहे हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल यह संभव तूफान के साथ pigmented जीवों की जांच करने के लिए बनाता है ।
यहां, हम कोशिकीय picocyanobacterium Prochlorococcusमें FtsZ अंगूठी संगठन छवि के लिए तूफान का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । FtsZ एक उच्च संरक्षित tubulin-तरह cytoskeletal प्रोटीन है जो एक अंगूठी संरचना (एक सेल10 की परिधि के चारों ओर Z अंगूठी) के रूप में polymerizes है और सेल के लिए आवश्यक है विभाजन11। संरक्षित Prochlorococcus कोशिकाओं पहले photobleached एक प्राथमिक विरोधी FtsZ एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि और immunostained को कम करने के लिए कर रहे हैं, और फिर एक माध्यमिक विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) एंटीबॉडी एक संयुग्मित के साथ fluorophore है (उदा. , Alexa Fluor ७५०) । अंततः, तूफान अलग सेल चक्र चरणों के दौरान Prochlorococcus में विस्तृत FtsZ अंगूठी संगठनों का पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम काफी cyanobacterium Prochlorococcus (चित्रा3 सी) के autofluorescence को कम करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन और, फिर, immunostain कोशिकाओं में प्रोटीन, जो हमें 3 डी FtsZ अध्ययन करने के लिए तूफान का उपयोग करने के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक उसे तकनीकी सहायता और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Daiying Xu धंयवाद । यह अध्ययन राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (परियोजना संख्या ४१४७६१४७) और हांगकांग विशेष प्रशासनिक क्षेत्र, चीन (परियोजना संख्या ६८९८१३ और १६१०३४१४) के अनुसंधान अनुदान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
