Fotoblekning gör super-upplösning Imaging av FtsZ Ring i det Cyanobakterien Prochlorococcus
Summary
Här beskriver vi en fotoblekning metod för att minska autofluorescens av cyanobakterier. Efter fotoblekning används stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi att erhålla tredimensionella super-upplösning bilder av Cyanobakterie FtsZ ringen.
Abstract
Super-resolution mikroskopi har använts att studera proteininteraktioner och subcellulära strukturer i många organismer. I fotosyntetiserande organismer, men super-upplösning imaging lateral upplösning är endast ~ 100 nm. Den låga upplösningen beror främst på hög autofluorescens bakgrunden av fotosyntetiska celler som orsakas av hög intensitet lasrar som krävs för super-upplösning imaging, såsom stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM). Här beskriver vi en fotoblekning-assisted STORM metod som utvecklades nyligen för imaging den marina picocyanobacterium Prochlorococcus. Efter fotoblekning, reduceras effektivt autofluorescens av Prochlorococcus så att stormen kan utföras med en lateral upplösning på ~ 10 nm. Med den här metoden vi förvärva i vivo tredimensionell (3-D) organisationen av FtsZ protein och karakterisera fyra olika FtsZ ring morfologier under cellcykeln av Prochlorococcus. Den metod som vi beskriver här kan antas för den super-upplösning imaging andra fotosyntetiska organismer.
Introduction
Super-upplösning microscopies kan bryta diffraktionsgränsen av ljus och ger bilder inom sub diffraktion resolutioner (< 200 nm). De har allmänt använts i många organismer för att studera protein lokalisering och subcellulära strukturer. Major super-resolution mikroskopi metoder omfattar strukturerade belysningen mikroskopi (SIM), stimulerat utsläpp utarmning mikroskopi (STED), STORM och photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). Mekanismerna och tillämpningar av dessa super-upplösning Mikroskop har varit recenserade någon annanstans1,2.
STORMEN kan uppnå en upplösning som är så hög som 10 nm med rumsliga avskiljandet3,4. För STORM, endast en molekyl inom en diffraktion begränsad region är aktiverad (”on”) och resten av molekylerna hålls inaktiverade (”off”). Av en ansamling av snabb switch-on – och off av enstaka molekyler, kan en ”diffraktion-obegränsad” bild vara genererade3. Under tiden, många typer av organiska färgämnen och fluorescerande proteiner är tillämpliga i STORM, möjliggör en enkel uppgradering från regelbundna fluorescensmikroskopi högupplösande mikroskopi5,6.
STORMEN har inte tillämpats allmänt i fotosyntetiska celler, såsom cyanobakterier, alger, och växtceller med kloroplaster7,8, som beror på faktumet att STORM kräver hög laser intensitet att driva photoswitching. Hög intensitet laser unfavorably väcker stark autofluorescens bakgrund i fotosyntetiska celler och stör singel-molekyl lokaliseringen i STORM imaging. För att kunna använda STORM för att undersöka den subcellulära strukturer eller proteininteraktioner i fotosyntetiska celler, utvecklade vi ett fotoblekning protokoll för att släcka bakgrunden autofluorescens signaler9. I en rutinmässig Immunofluorescerande färgningsproceduren utsätts exemplar till vitt ljus med en hög intensitet under blockerande steg, vilket sänker autofluorescens fotosyntetiska celler att uppfylla kraven för STORM. Således gör detta protokoll det möjligt att undersöka pigmenterade organismer med STORM.
Här beskriver vi protokollet om du vill använda STORM till bild FtsZ ring organisationen i de encelliga picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ är ett mycket tubulin-liknande cytoskeletal protein som polymerizes för att bilda en ringstruktur (Z ring) runt omkretsen av en cell10 och är viktigt för celldelningen11. Bevarade Prochlorococcus celler är första photobleached att minska autofluorescent bakgrund och immunostained med en primär anti-FtsZ antikropp och sedan en sekundär anti-kanin IgG (H + L) antikropp är konjugerat med en fluorophore (t.ex. , Alexa Fluor 750). Så småningom används STORM att iaktta de detaljerade FtsZ ring organisationerna i Prochlorococcus under olika cellcykelns faser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll, beskrev vi ett förfarande för att avsevärt minska autofluorescens av Cyanobakterien Prochlorococcus (figur 3 c) och, sedan immunostain proteinerna i cellerna, vilket gjorde det möjligt för oss att utnyttja STORM för att studera den 3D-FtsZ Ring morfologier i Prochlorococcus (figur 4). Detta protokoll kan antas för super-upplösning imaging i andra fotosyntetiska organismer.
Tidigare studier …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Daiying Xu för hennes tekniskt stöd och synpunkter på manuskriptet. Denna studie stöds av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (projektnummer 41476147) och beviljar Vetenskapsrådet för den särskilda administrativa regionen Hongkong, Kina (projektnummer 689813 och 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
