ניתוח קוואזי-metagenomic של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכין דגימות דנ א מזון, סביבתית microbiomes זיהוי מתואמת, subtyping של חיידקי סלמונלה דרך רצף quasimetagenomic. שימוש משולב של העשרת תרבות, immunomagnetic ההפרדה (IMS) ועקירה מרובים הגברה (מד א) מאפשרת ריכוז אפקטיבי של DNA גנומי סלמונלה מזון ודוגמאות סביבתיים.
Abstract
רצף קוואזי-metagenomics מתייחס ניתוח המבוסס על רצף של microbiomes שונה של מזון ודוגמאות סביבתיים. ב פרוטוקול זה, microbiome השינוי נועד להתרכז הדנ א של מזהם הפתוגן והקאה היעד כדי להקל על הזיהוי ו subtyping לנגיף בזרימת עבודה בודד. כאן, אנחנו מסבירים ומדגימים הצעדים הכנה דגימה לניתוח קוואזי-metagenomics של סלמונלה enterica מן המזון נציג ודוגמאות סביבתי כולל נבטי אלפלפה, פלפל שחור גרוס, בשר בקר, עוף חזה מטליות סביבתיים. דוגמאות הן נתון קודם העשרת תרבות של סלמונלה עבור מקוצר, הניתנים לשינוי משך (h 4 – 24). סלמונלה תאים ואז באופן סלקטיבי נלכדים מתרבות העשרה על-ידי immunomagnetic ההפרדה (IMS). לבסוף, הזחה מרובים הגברה (מד א) מבוצע כדי להגביר את ה-DNA של התאים שנתפסו-IMS. פלט ה-DNA של פרוטוקול זה יכול רציף על ידי פלטפורמות רצף תפוקה גבוהה. ניתן לבצע ניתוח ה-PCR כמותי אופציונלי כדי להחליף את רצף לגילוי סלמונלה או להעריך את הריכוז של סלמונלה DNA לפני רצף.
Introduction
Metagenomics רצף תיאורטית מאפשר זיהוי מתואמת subtyping של פתוגנים והקאה. עם זאת, דוגמאות מזון מציגים אתגרים לניתוח הפתוגן על ידי רצף ישירה של microbiome האוכל. ראשית, והקאה פתוגנים נוכחים לעתים קרובות ברמות נמוכות בדגימות מזון. רוב השיטות לזיהוי מהיר זמינים מסחרית עדיין דורשים h 8 – 48 culturing להעשיר את הפתוגן לתאים לזיהוי רמה1. שנית, מזונות רבים מכילים תאים microflora שופע ו/או מזון שהופך והקאה הפתוגן DNA חלק קטן של מזון metagenome, יעד חמקמק עבור זיהוי ו subtyping ישיר metagenomic רצף ה-DNA.
שינוי של מזון microbiomes דווחה כדי לאפשר ריכוז משמעותי של פתוגן והקאה דנ א כדי להקל על זיהוי מבוסס על רצף של שיגה לייצור הרעלן Escherichia coli2,3 ו- סלמונלה enterica4. כי שינוי המזון microbiomes הם עדיין תערובות של מינים שונים של חיידקים, רצף שלהם נקראת כמו ניתוח קוואזי-metagenomic4. Microbiome השינוי יכול להתבצע על ידי תרבות העשרה לבד2,3 או בשילוב עם immunomagnetic ההפרדה (IMS), מספר הזחה הגברה (מד א)4,5. IMS יכול ללכוד באופן סלקטיבי תאים הפתוגן מתרבות ההעשרה בעזרת מצופים נוגדן beads מגנטי. מד א ניתן להפיק כמויות מספיקות של דנ א גנומי רצף דרך ה-DNA פולימראז יעילים ביותר ɸ296. מד א-IMS אפשרה זיהוי הפתוגן תלויית תרבות של דגימות קליניות7, וקיצור של העשרת תרבות לגילוי קוואזי-metagenomic subtyping של חיידקי סלמונלה דגימות מזון4.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להכין את ה-DNA קוואזי-metagenomic של דוגמאות מזון כדי לאפשר ריכוז ממוקד של דנ א גנומי סלמונלה וזיהוי הבאים subtyping של החומר סלמונלה על ידי רצף. בהשוואה בשיטות הרגילות סלמונלה זיהוי8,9 , subtyping10, הגישה quasimetagenomic יכול לקצר משמעותית את משך העבודה של מזון מזוהם ודוגמאות הסביבה כדי מולקולרית תתי סוגים של המחלה על ידי המאחד השני בדרך כלל מופרדים ניתוחים לתוך זרימת עבודה יחידה. שיטה זו שימושית במיוחד עבור יישומים כגון והקאה פרוץ התגובה אחרים חקירות האחורי של מעקב שבו פתוגן עמיד subtyping נדרש בנוסף זיהוי הפתוגן, אספקה מהיר אנליטי הוא חשוב.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל שפע לעתים קרובות נמוכה נוכחות בהומוגנית של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות, העשרת תרבות לפני IMS-מד א הכרחי עדיין זיהוי סלמונלה , subtyping; לכן שלב קריטי של הפרוטוקול. כדי לזהות תנאים אופטימליים כדי להגביר את השפע של סלמונלה יחסית דוגמת רקע פלורה, עשויים להעריך העשרה שונים מדיה ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות מארק האריסון, הירש גוון של האוניברסיטה של גאורגיה למתן בחביבות המתח חיידקי ותמיכה אחרים במחקר זה.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y., et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Hyeon, J. Y., Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).
- Hosono, S., et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual’s Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X., et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- . Microbiology Laboratory Guidebook Available from: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook (2018)
- . Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2018)
- Malorny, B., et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).
- Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S., et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
