Quasi-metagenomischen Analyse Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um DNA-Proben von Lebensmitteln und ökologischen Mikrobiome abgestimmte Erkennung und Subtypisierung von Salmonellen durch Sequenzierung Quasimetagenomic vorzubereiten. Der kombinierte Einsatz von Kultur Bereicherung, Immunomagnetic Separation (IMS) und mehrfache Verschiebung Verstärkung (MDA) ermöglicht wirksame Konzentration der Salmonellen genomische DNA aus Lebensmitteln und Umweltproben.
Abstract
Quasi-Metagenomik Sequenzierung bezieht sich auf die Sequenzierung basierende Analyse der veränderten Mikrobiome von Lebensmitteln und Umweltproben. In diesem Protokoll soll Microbiome Modifikation genomischer DNA ein Ziel durch Lebensmittel übertragene Erreger Kontaminanten, die Erkennung zu erleichtern und Subtypisierung des Erregers in einem Workflow zu konzentrieren. Hier, wir erklären und zeigen die Probe Vorbereitungsschritte für die quasi-Metagenomik Analyse Salmonella Enterica aus repräsentativen Lebensmitteln und Umweltproben einschließlich Alfalfasprossen, gemahlener schwarzer Pfeffer, Hackfleisch, Hähnchen Brust und ökologischen Tupfer. Proben werden zuerst die Kultur Anreicherung von Salmonellen für eine verkürzte und einstellbare Dauer (4 – 24 h) unterzogen. Salmonellen -Zellen sind dann selektiv aus der Bereicherung Kultur von Immunomagnetic Trennung (IMS) erfasst. Zu guter Letzt wird mehrere Verschiebung Verstärkung (MDA) durchgeführt, um DNA aus IMS erfasst Zellen verstärken. Die DNA-Ausgabe dieses Protokolls kann von Hochdurchsatz-Sequenzierung Plattformen sequenziert werden. Eine optionale quantitativen PCR-Analysen kann durchgeführt werden, um Sequenzierung für Salmonellen -Nachweis zu ersetzen oder die Konzentration von Salmonellen DNA vor der Sequenzierung zu bewerten.
Introduction
Metagenomik Sequenzierung ermöglicht theoretisch abgestimmte Erkennung und Subtypisierung von lebensmittelbedingten Krankheitserregern. Jedoch Herausforderungen Lebensmittelproben auf die Analyse der Erreger durch direkte Sequenzierung von Essen Microbiome. Erstens sind lebensmittelbedingten Krankheitserregern häufig auf einem niedrigen Niveau in Lebensmittelproben. Die meisten im Handel erhältlichen Schnellnachweis Methoden noch benötigen 8 – 48 h Kultivierung Erreger Zellen nachweisbar Ebene1zu bereichern. Zweitens: viele Lebensmittel enthalten reichlich Mikroflora Zellen und/oder Essen DNA, damit durch Lebensmittel übertragene Erreger-DNA einen kleinen Bruchteil der Nahrung Metagenom und ein schwer erreichbares Ziel für Erkennung und Subtypisierung durch metagenomische Sequenzierung direkte.
Änderung der Nahrung Mikrobiome wurde berichtet, dass erhebliche Konzentration Foodborne pathogens DNA-Sequenzierung-basierte Erkennung von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli2,3 und zu erleichtern Salmonella Enterica4. Weil Essen geändert Mikrobiome sind noch Mischungen aus verschiedenen Mikrobenarten, ihre Sequenzierung wird als quasi-metagenomischen Analyse4bezeichnet. Microbiome Modifikation kann durch Kultur Bereicherung allein2,3 oder in Kombination mit Immunomagnetic Trennung (IMS) und mehrfache Verschiebung Verstärkung (MDA)4,5durchgeführt werden. IMS können selektiv Erreger Zellen aus der Bereicherung Kultur über Antikörper-beschichtete magnetische Beads erfassen. MDA kann ausreichende Mengen von genomischer DNA Sequenzierung durch die hocheffiziente ɸ29 DNA-Polymerase6generieren. IMS-MDA hat kulturunabhängig Erregernachweis aus klinischen Proben7, und Verkürzung der Kultur Bereicherung für quasi-metagenomische Erkennung und Subtypisierung von Salmonellen in Lebensmitteln Proben4erlaubt.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, quasi metagenomic DNA von Lebensmittelproben erlauben gezielte Konzentration von Salmonellen genomischer DNA und anschließenden Erkennung und Subtypisierung von Salmonellen Verunreinigung durch Sequenzierung vorzubereiten. Im Vergleich zu standard-Methoden für Salmonellen Erkennung8,9 und10Subtypisierung, kann der Quasimetagenomic Ansatz die Bearbeitungszeit von kontaminierten Lebensmitteln und Umweltproben, erheblich verkürzen. molekularen Subtypen des Erregers durch die Vereinheitlichung der beides in der Regel getrennt Analysen in einem Workflow. Diese Methode eignet sich besonders für Anwendungen wie lebensmittelbedingten Ausbrüchen und andere Spur zurück Untersuchungen, wo robuste Erreger Subtypisierung neben Erregernachweis erforderlich ist und schnelle analytische Turnaround ist wichtig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der oft niedrigen Fülle und in homogenen Vorkommen von Salmonellen in Lebensmitteln und Umweltproben ist Kultur Bereicherung vor IMS-MDA zum Nachweis von Salmonellen und Subtypisierung weiterhin erforderlich; Es ist daher ein wichtiger Schritt des Protokolls. Um optimale Bedingungen für die Fülle von Salmonellen relativ zum Beispiel Hintergrund Flora erhöhen zu identifizieren, können verschiedene Bereicherung Medien für bestimmte Proben ausgewertet werden. Nach MLG und BAM selekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Danke Mark Harrison und Gwen Hirsch von der University of Georgia freundlicherweise dafür den Bakterienstamm und sonstige Unterstützung zu dieser Studie.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., & Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y. et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
- Hyeon, J. Y., & Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63 111-116 (2017).
- Hosono, S. et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M. et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., & Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., & Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X. et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. <www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook> (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., & Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella., <www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm> (2018).
- Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., & Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis S, P. J., Luo Y, Payne J, Shpuntoff A, Rand H, Strain E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20) (2015).
- Zhang, S. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S. et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., & Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
