Quasi-metagenomic análise de Salmonella de alimentos e amostras ambientais
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para preparar amostras de DNA de alimentos e ambiental microbiomes para detecção concertada e subtipos de salmonelas através do sequenciamento de quasimetagenomic. O uso combinado de enriquecimento da cultura, separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA) permite a concentração eficaz de salmonelas de DNA genômico de amostras ambientais e alimentos.
Abstract
Sequenciamento de quasi-metagenomics refere-se à análise baseada no sequenciamento de microbiomes modificada de alimentos e amostras ambientais. Neste protocolo, modificação de microbiome é projetada para concentrar o DNA genômico de um contaminante de patógeno de origem alimentar alvo para facilitar a detecção e subtipos do patógeno em um único fluxo de trabalho. Aqui, vamos explicar e demonstrar as etapas de preparação de amostra para análise de Salmonella typhi quasi-metagenômica de representante alimentos e amostras ambientais, incluindo os rebentos de alfafa, pimenta preta moída, carne à terra, peito de frango e amostras ambientais. Amostras são submetidas primeiro para o enriquecimento da cultura de Salmonella para uma duração encurtada e ajustável (4 – 24 h). Células de Salmonella são então seletivamente capturadas da cultura enriquecimento por Fima separação (IMS). Finalmente, vários deslocamento amplificação (MDA) é executada para amplificar o DNA das células IMS-capturado. A saída de DNA do presente protocolo pode ser sequenciada por plataformas de sequenciamento de alto rendimento. Uma análise PCR quantitativa opcional pode ser realizada para substituir o sequenciamento para a deteção de Salmonella ou avaliar a concentração de salmonela DNA antes de sequenciamento.
Introduction
Metagenômica sequenciamento teoricamente permite a deteção concertada e subtipos de agentes patogénicos de origem alimentar. No entanto, amostras de alimentos apresentam desafios para a análise de patógeno por sequenciamento direto de microbiome a comida. Primeiro, agentes patogénicos de origem alimentar estão frequentemente presentes em níveis baixos em amostras de alimentos. A maioria dos métodos de detecção rápida disponível comercialmente ainda exige 8 – 48 h cultivo para enriquecer as células do patógeno a um nível detectável1. Em segundo lugar, muitos alimentos contêm células microflora abundante e/ou comida DNA, fazendo o DNA de patógeno de origem alimentar uma pequena fração de metagenome de comida e um alvo evasivo para deteção e subtipos directo por sequenciamento de metagenomic.
Modificação de microbiomes de alimentos tem sido relatada para permitir uma concentração substancial de patógeno de origem alimentar DNA para facilitar a detecção baseada em sequenciamento de Shiga toxina-produzindo Escherichia coli2,3 e Salmonella typhi4. Porque os alimentos modificados microbiomes ainda são misturas de diferentes espécies microbianas, seu sequenciamento é denominado como análise de quasi-metagenomic4. Microbiome modificação pode ser executada por cultura enriquecimento sozinho2,3 , ou em combinação com separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA)4,5. IMS seletivamente pode capturar células do patógeno de cultura de enriquecimento através de grânulos magnéticos revestido de anticorpo. MDA pode gerar quantidades suficientes de DNA genômico para sequenciamento através de de DNA polimerase o altamente eficiente ɸ296. IMS-MDA permitiu a deteção do agente patogénico independente de cultura de amostras clínicas7e encurtamento do enriquecimento da cultura para a deteção de quasi-metagenomic e subtipos de salmonelas em alimentos amostras4.
O objetivo geral deste método é preparar DNA quasi-metagenomic de amostras de alimentos para permitir a concentração alvo de DNA genômico de Salmonella e detecção subsequente e subtipos do contaminante Salmonella por sequenciamento. Em comparação com métodos padrão para a deteção de Salmonella 8,9 e10de subtipos, a abordagem quasimetagenomic substancialmente pode encurtar o tempo de retorno de alimentos contaminados e amostras ambientais para subtipos moleculares do patógeno Unificando os dois normalmente separaram análises em um único fluxo de trabalho. Este método é particularmente útil para aplicações como reação a epidemias transmitidas por alimentos e outras investigações de volta de rastreamento onde patógeno robusto subtipos é necessário além de deteção de patógenos e rápida reversão analítica é importante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Por causa da abundância, muitas vezes de baixa e homogênea em presença de salmonelas em alimentos e amostras ambientais, enriquecimento de cultura antes de IMS-MDA é ainda necessário para a detecção de Salmonella e subtipos; é, portanto, uma etapa crítica do protocolo. Para identificar as condições ideais para aumentar a abundância de Salmonella em relação à flora de fundo de amostra, mídia de enriquecimento diferentes pode ser avaliadas para amostras específicas. De acordo com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a Mark Harrison e Gwen Hirsch da Universidade da Geórgia para fornecer gentilmente a estirpe bacteriana e outro apoio para este estudo.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y., et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Hyeon, J. Y., Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).
- Hosono, S., et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual’s Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X., et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- . Microbiology Laboratory Guidebook Available from: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook (2018)
- . Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2018)
- Malorny, B., et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).
- Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S., et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
