Cuantitativa la célula de asesino inmunoglobulina-como receptor (KIR) semiautomático escribir (qKAT) es un método simple, de alto rendimiento y rentable para copiar número genes KIR de tipo para su aplicación en estudios de Asociación de población y enfermedades.
Receptores de inmunoglobulina-como las células Killer (IIC) son un conjunto de receptores inmunes inhibidoras y activadoras, natural killer (NK) y células T, codificadas por un clúster polimórfico de los genes en el cromosoma 19. Sus ligandos mejor caracterizadas son las moléculas de leucocito humano antígeno (HLA) que se codifican en el locus de (MHC) complejo principal de histocompatibilidad en el cromosoma 6. Hay pruebas sustanciales de que juegan un papel importante en inmunidad, reproducción y trasplante, lo que es fundamental contar con técnicas que pueden con exactitud el genotipo de ellos. Sin embargo, secuencia de alta homología, así como alélica y variación en número de copias, dificulta a genotipo y eficiente los métodos de diseño que pueden exactamente todos los genes KIR . Los métodos tradicionales se limitan generalmente en la resolución de los datos obtenidos, rendimiento, rentabilidad y el tiempo necesario para establecer y ejecutar los experimentos. Describimos un método llamado cuantitativa KIR semiautomático escribir (qKAT), que es un método de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real multiplex de alto rendimiento que puede determinar el número de copia del gene de todos los genes en el locus KIR . qKAT es un método simple de alto rendimiento que puede ofrecer alta resolución KIR copia datos del número, que además permite inferir las variaciones en los haplotipos estructuralmente polimórficos que abarcan los. Estos datos copia número y haplotipo pueden ser beneficiosos para los estudios sobre asociaciones a gran escala enfermedad, genética de la población, así como las investigaciones sobre la expresión y las interacciones funcionales entre KIR y HLA.
En los seres humanos, el asesino inmunoglobulina-como receptor(KIR) lugar geométrico se mapea en el brazo largo del cromosoma 19 en el complejo receptor del leucocito (LRC). Este lugar geométrico es alrededor de 150 kb de longitud e incluye 15 KIR genes dispuestos cabeza a cola. Los loci KIR que actualmente se conocen son KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, 5 KIR2DS1, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, y dos pseudogenes, KIR2DP1 y KIR3DP1. Los genes KIR codifican para dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D) dominio de inmunoglobulina-como los receptores con poco (S; activar) o largo (L; inhibitorio) colas citoplasmáticas, que son expresadas por las células asesinas naturales (NK) y los subconjuntos de T células. Variación en número de copias expuestas dentro de las formas de locus KIR diversos haplotipos con gen variable contenido1. Recombinación homóloga no alélica (NAHR), facilitado por un arreglo cerca gene de cabeza a la cola y la secuencia de alta homología, es el mecanismo propuesto para ser responsable de la variabilidad haplotypic. Han reportado más de 100 diferentes haplotipos en las poblaciones en todo el mundo1,2,3,4. Estos haplotipos se pueden dividir en dos grandes grupos: los haplotipos A y B. El haplotipo A contiene 7 genes KIR : KIR3DL3 KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1y KIR3DL2, que son genes KIR inhibitorios y la activación KIR gen KIR2DS4. Sin embargo, hasta 70% de individuos de origen europeo que son homocigotos para el haplotipo KIR A exclusivamente llevar una forma no funcional “eliminación” de KIR2DS45,6. Todas otras combinaciones de genes KIR forman haplotipos del grupo B, incluyendo al menos uno de los genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, y KIR2DL5y por lo general incluyen dos o más genes KIR activadoras.
Las moléculas HLA de clase I han sido identificados como ligandos para ciertos receptores inhibitorios (KIR2DL1 KIR2DL2, KIR2DL3y KIR3DL1), activando Receptores (KIR2DS1 KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5y KIR3DS1), y para KIR2DL4, que es un único KIR que contiene una cola citoplásmico largo como otros receptores KIR inhibitorios, pero también tiene un residuo cargado positivamente cerca del dominio extracelular que es común característica de otros receptores KIR activadoras. La combinación de variantes dentro de los genes KIR y los genes HLA influye en la interacción del ligando del receptor formas potenciales NK célula capacidad de respuesta en el nivel individual7,8. Evidencia de los estudios de asociación genética ha indicado que KIR desempeña un papel en la resistencia viral (por ejemplo., virus de la inmunodeficiencia humana [VIH]9 y hepatitis C [VHC] de virus10), el éxito del trasplante 11, el riesgo de trastornos del embarazo y de éxito reproductivo12,13, la protección contra la recaída después de alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) del trasplante14,15, 16y el riesgo de cáncer17.
La combinación de secuencia de alta homología y alélicas y haplotypic diversidad presenta desafíos en la tarea de con precisión los genes KIR genotyping. Métodos convencionales para escribir genes KIR incluyen cartilla de secuencia específica (SSP) polimerasa reacción en cadena (PCR)18,19,20, sonda de oligonucleótidos específicos de secuencia (SSOP) PCR21, y láser asistida por matriz desorción de ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS)22. Los inconvenientes de estas técnicas son que sólo proporcionan información parcial sobre el genotipo de un individuo mientras que también siendo laborioso realizar. Recientemente se ha aplicado secuenciación de próxima generación (NGS) para escribir el locus KIR específicamente. Mientras que este método es muy potente, puede ser costoso de ejecutar y es desperdiciador de tiempo para llevar a cabo controles de datos y análisis profundo.
qKAT es un método cuantitativo de PCR de alto rendimiento. Mientras que los métodos convencionales son laborioso y desperdiciador de tiempo, este método hace posible ejecutar casi 1.000 muestras genomic de la DNA (gDNA) en cinco días y le da el genotipo KIR , así como el número de copias del gen. qKAT consiste en diez reacciones múltiplexes, cada una de ellas apunta a dos loci KIR y un gen de referencia de un número fijo de copia en el genoma (STAT6) utilizado para la cuantificación relativa de los genes KIR Copiar número23. Este análisis se ha utilizado con éxito en estudios que involucran población paneles y cohortes de enfermedad en enfermedades infecciosas como el VHC, condiciones autoinmunes como la diabetes tipo 1 y trastornos del embarazo como preeclampsia, así como proporcionar una genética apoyo a estudios dirigidos a entender el NK célula función1,4,24,25,26.
Describimos un nuevo método semiautomático de alto rendimiento, llamado qKAT, que facilita la copia número tipificación de genes KIR . El método es una mejora sobre los métodos convencionales como SSP-PCR, que son de bajo rendimiento y sólo pueden indicar la presencia o ausencia de estos genes altamente polimórficos.
La exactitud de los datos del número de copia obtenidas depende de múltiples factores, incluyendo la calidad y uniformidad de la concentración de las muestras del gDNA y la calidad de los reactivos. La calidad y precisión de las muestras del gDNA a través de una placa son muy importantes ya que las variaciones en la concentración a través de la placa pueden resultar en errores en el cálculo del número de copia. Puesto que los análisis se validaron utilizando conjuntos de muestra de origen Europea, datos de cohortes de otras partes del mundo requieren controles más a fondo. Esto es para asegurar que casos de deserción del alelo o atascamiento no específico primer punta de prueba no son malinterpretados como variación en número de copias.
Mientras que los ensayos fueron diseñados y optimizados para funcionar como alto rendimiento, puede ser modificados para ejecutar menos ejemplos. La métrica de confianza en el software de análisis número de copia es afectada cuando se analizan menos muestras, pero esto puede mejorarse si se incluyen muestras de ADN genómicas de control con un conocido número de copia de genes KIR en la placa y muestra más repeticiones incluido.
Laboratorios sin líquido y placa-manipulación de robots, mezcla principal puede dispensar utilizando pipetas de varios canales y placas pueden cargarse manualmente en el instrumento de la qPCR.
El objetivo principal detrás del desarrollo de qKAT fue crear un método de alto rendimiento, alta resolución y rentable simple, genotipo IIC para enfermedad estudios de asociación. Esto fue alcanzado con éxito ya que qKAT se ha empleado en la investigación sobre el papel de KIR en varios estudios de Asociación de enfermedad grande, incluyendo una gama de enfermedades infecciosas, condiciones autoinmunes y embarazo trastornos4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
El proyecto recibido financiamiento del Consejo de investigación médica (MRC), el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo el programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo no. 695551 de la subvención) y el Instituto Nacional de salud (NIH) de Cambridge Biomédica centro de investigación y NIH investigación sangre y trasplante de unidad de investigación (NIHR BTRU) en donación de órganos y trasplante en la Universidad de Cambridge y en colaboración con sangre de NHS y trasplante (NHSBT). Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente las del NHS, el NIHR, el Departamento de salud o la NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |