आइसोलेटिंग, अनुक्रमण और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से extracellular micrornas का विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि सेल संस्कृति मीडिया से छोटे आरएनए पुस्तकालय निर्माण और अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए extracellular micrornas शुद्ध करने के लिए कैसे । विभिंन गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों को समझने के लिए क्या जब exrnas की तरह कम इनपुट नमूनों के साथ काम करने की उंमीद करने के लिए पाठकों को अनुमति देने के लिए वर्णित हैं ।
Abstract
extracellular और प्रसारित rnas (exrna) शरीर के कई कोशिका प्रकार के द्वारा उत्पादित कर रहे हैं और लार, प्लाज्मा, सीरम, दूध और मूत्र के रूप में कई शारीरिक तरल पदार्थ में मौजूद. इन rnas के एक सबसेट posttranscriptional नियामकों-micrornas (mirnas) हैं । विशिष्ट सेल प्रकार द्वारा उत्पादित mirnas चित्रित करने के लिए, इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों फसल और प्रोफाइल exrnas कोशिकाओं के एक सबसेट से व्युत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मध्योतक स्टेम कोशिकाओं के स्रावित कारकों कई रोगों को समाप्त करने में फंसाया जाता है और यहां में विट्रो मॉडल प्रणाली के रूप में प्रयोग किया जाता है । इस कागज संग्रह की प्रक्रिया का वर्णन, छोटे आरएनए के शुद्धिकरण और पुस्तकालय पीढ़ी के अनुक्रम extracellular mirnas करने के लिए । संस्कृति मीडिया से exrnas कम आरएनए इनपुट नमूने, जो अनुकूलित प्रक्रियाओं के लिए कॉल किया जा रहा द्वारा सेलुलर आरएनए से अलग । इस प्रोटोकॉल exrna शुद्धि और अनुक्रमण के दौरान प्रत्येक कदम पर गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों दिखा रहा है, संस्कृति मीडिया से छोटे exrna अनुक्रमण के लिए एक व्यापक गाइड प्रदान करता है.
Introduction
extracellular और प्रसारित rnas (exrnas) विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थ में मौजूद हैं और rnases1,2की ओर प्रतिरोधी रहे हैं. उनके उच्च बहुतायत, स्थिरता और पहुंच में आसानी नैदानिक आकलन और शकुन मार्करों के रूप में के लिए आकर्षक है3। exrnas के लिए परिवहन की विधा extracellular vesicles (evs), लिपोप्रोटीन के साथ सहयोग (जैसे उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन शामिल हैं; एचडीएल) और राइबोन्यूलियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (जैसे Argonaute2 कॉम्प्लेक्स के साथ)4.
exrnas का एक सबसेट micrornas (mirnas), जो छोटे गैर के बारे में 22 nt के rnas है कि posttranscriptional जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कर रहे हैं । पूर्व-मिर्नास सेल-सेल संचार और सेल होमियोस्टेसिस के विनियमन में फंसा दिया गया है5. उदाहरण के लिए, एचडीएल इंटरसेलुलर आसंजन अणु 1 (ईकैम-1) और सूजन6को दबाने के लिए एंडोथेलीयल कोशिकाओं को पूर्व-मीर-२२३ बचाता है । दिलचस्प है, मीर-२२३ भी ल्यूकोसाइट्स से फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को extracellular vesicles द्वारा जाया देखा जाता है, उंहें एक अधिक आक्रामक phenotype7पर लेने के लिए प्रोग्रामिंग । इस प्रकार, विभिंन शारीरिक तरल पदार्थ और सेल संस्कृति माध्यम से पूर्व mirnas के transcriptome बहुत पूर्व mirnas संकेतन की हमारी समझ में सुधार होगा ।
छोटे आरएनए अनुक्रमण (छोटे आरएनए seq) छोटे rna के transcriptomics को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है । न केवल विभिंन नमूनों के बीच तुलना किया जा सकता है व्यवकलीय व्यक्त ज्ञात rnas, लेकिन उपंयास छोटे rnas भी पता लगाया जा सकता है और विशेषता । नतीजतन, यह भी एक मजबूत विधि अलग शर्तों के तहत व्यवकलीय व्यक्त mirnas की पहचान करने के लिए है । हालांकि, छोटे आरएनए सीक्यू की बाधाओं में से एक छोटी आरएनए सीक्यू पुस्तकालयों को सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ, लार, मूत्र, दूध, सीरम और संस्कृति मीडिया जैसे कम exrna इनपुट तरल पदार्थ से पैदा करने में कठिनाई है । illumina से truseq छोटे आरएनए लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल की आवश्यकता है लगभग 1 μg उच्च गुणवत्ता कुल आरएनए और नेबनेक्स्ट स्मॉल आरएनए लाइब्रेरी तैयारी सेट प्रोटोकॉल ंयू इंग्लैंड biolabs से १०० ng-1 μg of rna8,9की आवश्यकता है । oftentimes, इन नमूनों से कुल आरएनए पारंपरिक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए पता लगाने की सीमा से नीचे हैं ।
शारीरिक तरल पदार्थ से व्युत्पंन पूर्व mirnas संभावित अच्छे शकुन और नैदानिक मार्कर हैं । हालांकि, कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए या विशिष्ट पूर्व mirnas की उत्पत्ति का निर्धारण करने के लिए, सेल संस्कृति प्रणालियों अक्सर बजाय इस्तेमाल कर रहे हैं. mesenchymal स्टेम सेल (mscs) बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है क्योंकि उनके evs मायोकार्डियल रोधगलन, अल्जाइमर रोग और भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग10सहित कई रोगों को समाप्त करने में फंसाया गया है । यहां, हम अस्थि मज्जा से पूर्व mirnas के शुद्धिकरण-व्युत्पन्न mscs (bmscs) और विशिष्ट छोटे आरएनए पुस्तकालय निर्माण, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण (चित्रा 1) का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया कदम का प्रदर्शन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक प्रोटोकॉल exrnas कि कम इनपुट नमूनों से अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण सक्षम बनाता है की अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए वर्णन । EV और exrna अलगाव के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल का पालन महत्वपूर्ण है क्योंकि यहां ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके तकनीकी सहायता के लिए inano में श्री क्लॉस बस और सुश्री रीता rosendahl के लिए आभारी हैं । अपने ultracentrifuge के हमारे लगातार उपयोग की अनुमति के लिए डॉ डैनियल otzen के लिए विशेष धन्यवाद । इस स्टडी को इनोवेशन फंड डेनमार्क (muster project) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
