격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석
Summary
이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.
Abstract
세포 외 및 순환 RNAs (exRNA)는 신체의 많은 세포 유형에 의해 생산과 타 액, 혈장, 혈 청, 우유와 소변 등 수많은 체액에 존재. 이러한 RNAs의 한 하위 집합은 posttranscriptional 레 귤 레이 터-microRNAs (miRNAs). 특정 세포 유형에 의해 생산 하는 miRNAs의 윤곽을 그리 다 생체 외에서 문화 시스템 수확 사용할 수와 프로필 exRNAs 셀의 한 하위 집합에서 파생 된. 중간 엽 줄기 세포의 secreted 요소 경감 수많은 질병에 연루 되 고 여기에 체 외 모델 시스템으로 사용 된다. 이 문서 수집의 과정, 작은 RNA의 정화 및 시퀀스 extracellular miRNAs에 라이브러리 생성에 설명합니다. 문화 미디어에서 ExRNAs 낮은 RNA 입력된 샘플, 최적화 된 프로시저를 호출 하 여 세포질 RNA에서 다. 이 프로토콜에 포괄적인 가이드를 작은 exRNA 시퀀싱 문화 미디어에서 exRNA 정화 및 시퀀싱 하는 동안 각 단계에서 품질 관리 검사점을 보여주는 제공 합니다.
Introduction
세포 외 및 순환 RNAs (exRNAs) 다양 한 체액에 존재 하 고 저항 RNases1,2쪽으로 있습니다. 그들의 높은 풍부, 안정성과 접근의 용이성 진단 및 예 후 마커3임상 평가 대 한 매력이 있습니다. ExRNAs에 대 한 전송 모드 포함 extracellular 소포 (EVs), 단백질 (예: 고밀도 지 단백;와 협회 HDL) 및 ribonucleoprotein 단지 (와 같은 Argonaute2 단지와 함께)4.
ExRNAs의 하위 집합은 작은 비 코딩 RNAs의 약 22 microRNAs (miRNAs), nt posttranscriptional 유전자 발현을 조절 하는. 전 miRNAs 셀 통신 및 세포 항상성5의 규칙에 연루 되었습니다. HDL 전-미르-223 내 피 세포 세포 접착 분자 1 (ICAM-1)를 억 누르기 위해 제공 하는 예를 들어와 염증을6. 흥미롭게도, 미르-223는 또한 더 많은 침략 형7에 그들을 프로그래밍 하는 폐 암 세포를 백혈구에서 extracellular 소포에 의해 수송 여겨진다. 따라서, 다양 한 체액 및 세포 배양 매체에서 전 miRNAs의 transcriptome 크게 전 미르 신호에 대 한 우리의 이해를 향상 됩니다.
작은 RNA 시퀀싱 (작은 RNA seq) 작은 RNAs의 transcriptomics를 이해 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 뿐만 아니라 다른 샘플 차동 표현된 알려진된 RNAs 사이 비교 될 수 있다 하지만 소설 작은 RNAs 수 또한 감지 하 고 특징. 따라서, 그것은 또한 다른 조건 하에서 차동 표현된 miRNAs 식별 하는 강력한 방법입니다. 그러나, 작은 RNA seq의 장애물 중 하나는 뇌 척수의 체액, 타 액, 소변, 우유, 혈 청 및 문화 미디어 같은 낮은 exRNA 입력된 액체에서 작은 RNA seq 라이브러리 생성 어려움입니다. TruSeq 작은 RNA 라이브러리 준비 프로토콜 Illumina에서 고품질 총 RNA의 약 1 µ g 필요 하며 뉴 잉글랜드 Biolabs에서 NEBNext 작은 RNA 라이브러리 준비 설정 프로토콜 100 ng-1 µ g의 RNA8,9. 때때로, 이러한 샘플에서 총 RNA 기존의 대 한 UV 광에 대 한 검출 한계 같습니다.
체액에서 파생 된 전 miRNAs는 잠재적으로 좋은 전조와 진단 마커. 그러나, 기능 효과 연구 하거나 특정 전 miRNAs의 원산지 결정, 세포 배양 시스템 자주 대신 사용 됩니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 그들의 EVs 심근 경색, Alzheimer의 질병과 접 붙이다 비교 호스트 질병10를 포함 하 여 많은 질병을 경감에 연루 되어 있기 때문에 광범위 하 게 연구 되었습니다 있다. 여기, 우리 골 수 파생 된 MSCs (BMSCs)와 작은 RNA 도서관 건설, 시퀀싱 및 데이터 분석 (그림 1)을 최적화 하는 데 사용 하는 특정 단계에서 전 miRNAs의 정화를 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 낮은 입력된 샘플에서 차동 식 분석을 가능 하 게 exRNAs의 다음 세대 시퀀싱에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 심지어 작은 변경 (즉, ultracentrifugation 단계 또는 회전자 유형 변경)는 transcriptome 영향을 미칠 수 있기 때문에 miRNA 레벨13,14EV 및 exRNA 격리에 대 한 특정 프로토콜을 준수 하는 것이 중요 합니다. 따라서, 어떻게는 exRNA는 절연, 결과 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 iNANO에 감사 미스터 클로스 버스 하 양 리 타 Rosendahl입니다. 그의 ultracentrifuge의 빈번한 사용을 허용에 대 한 특별 박사 다니엘 Otzen 감사 합니다. 이 연구는 혁신 기금 덴마크 (소집 프로젝트)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
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