Effecten van smaak signalering eiwitten afschaffing op ontsteking van de darm in een muismodel van Inflammatory Bowel Disease
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het onderzoek naar het effect van de ongeldigheidsverklaring van gustation-gerelateerde genen op immuunresponsen bij een dextran sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde muismodel van inflammatory bowel disease (IBD).
Abstract
Ontstekingsdarmziekte (IBD) is één van de immuun-gerelateerde gastro-intestinale aandoeningen, met inbegrip van colitis ulcerosa en de ziekte van Crohn, dat is van invloed op de levenskwaliteit van miljoenen mensen wereldwijd. IBD symptomen zijn buikpijn, diarree, en rectale bloeden, dat uit de interacties tussen de darmflora, voedingsbestanddelen, intestinale epitheliale cellen en immuuncellen voortvloeien kan. Het is van bijzonder belang voor het beoordelen van de invloed van elke belangrijke gen uitgedrukt in de intestinale epitheliale en immuun cellen op ontsteking in de dikke darm. G eiwit-gekoppelde smaak receptoren, waaronder G eiwit subeenheid α-gustducin en andere signalering eiwitten, gevonden in de darmen. Hier, gebruiken we α-gustducin als vertegenwoordiger en beschrijven een dextran sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde IBD model te evalueren van het effect van smaak genmutaties op gut mucosale immuniteit en ontsteking. Deze methode combineert gentechnologie knock-out met het chemisch geïnduceerde IBD-model, en dus kan worden toegepast voor de beoordeling van de resultaten van smaak gene ongeldigheidsverklaring evenals andere genen die kunnen exuberate of temperen de DSS-geïnduceerde immuunrespons in de dikke darm. Mutant muizen worden met DSS beheerd gedurende een bepaalde periode waarin hun lichaamsgewicht, kruk en rectale bloeden worden gecontroleerd en geregistreerd. Op verschillende tijdstippen tijdens beheer, zijn sommige muizen euthanized, dan de maten en gewichten van hun milt en dubbele punten worden gemeten en darmen weefsels worden verzameld en verwerkt voor histologisch en gen expressie analyses. De gegevens tonen aan dat de resultaten van de knock-out α-gustducin in overmatig gewichtsverlies, diarree, intestinale bloedingen, weefselschade en ontsteking vs. wild-type muizen. Omdat de ernst van de ontsteking geïnduceerde wordt beïnvloed door muis stammen, huisvesting, milieu en voeding, is optimalisatie van DSS concentratie en administratie duur in een proefproject bijzonder belangrijk. Door deze factoren aan te passen, kan deze methode worden toegepast om te beoordelen van zowel anti – en pro-inflammatoire effecten.
Introduction
De twee belangrijkste vormen van ontstekingsdarmziekte (IBD), ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) worden gekenmerkt door chronische remittent of progressief inflammatoire aandoeningen van de darm met multifactoriële etiologie1,2 . De ontwikkeling van IBD is afhankelijk van genetische alsmede bepaalde omgevingsfactoren, zoals voeding, antibioticagebruik, en belangrijker, pathogene infecties. De etiologie en regulerende moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan IBD zijn echter nog onduidelijk. Vandaar, zijn vele chemisch geïnduceerde IBD diermodellen gebouwd en toegepast om te bakenen de pathogenese en de regulerende mechanismen en de doeltreffendheid van menselijke therapeutics3.
Smaak receptoren zijn G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) en zijn geclassificeerd als twee belangrijke types: type I (T1Rs), en type II (T2Rs) die zoete, umami en bittere stoffen te detecteren. Smaak signalering cascades worden ingeleid door tastant te binden aan T1Rs of T2Rs, het activeren van de heterotrimeric G eiwitten bestaande uit α-gustducin en een Gβγ dimeer en leidt tot het vrijgeven van de subeenheden van Gβγ. De Gβγ groep stimuleert op zijn beurt de stroomafwaartse effector enzym phospholipase C-β2 (PLC-β2). Geactiveerde PLC-β2 dan phosphatidylinositol-4,5-difosfaat ontstabiel in twee intracellulaire secundaire boodschappers [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP-3) en diacylglycerol], en IP-3 bindt aan en open het kanaal-receptor IP-3 R3, het vrijgeven van calciumionen uit het endoplasmatisch reticulum. Dit leidt uiteindelijk tot de opening van voorbijgaande receptor potentiële ionkanaal Trpm5 en vrijlating van de neurotransmitter ATP op de smaak zenuwen4,5,6,7. Toch zijn de signaalroutes van zoute en zure smaak andere en onafhankelijke van zoete, umami en bittere smaken8. Bovendien, bestaan de componenten van smaak GPCRs en downstream eiwitten in verschillende extra mondelinge weefsels. Recente studies aangegeven dat α-gustducin, is de belangrijkste component van de smaak signalering, gevonden moet worden uitgedrukt in de intestinale mucosa. Verdere studies zijn nodig om te begrijpen van de functies van deze smaak signalering van componenten in extra mondelinge weefsels9,10.
De hier beschreven methode wordt gebruikt om aan te geven van de functies van de smaak signalering eiwitten uitgedrukt in extra mondelinge weefsels. Wij combineren een transgene muis lijn ontwikkeld voor signalering cascades in smaakpapillen met het chemisch geïnduceerde colitis model uitgezet. Grotendeels te wijten aan de procedurele eenvoud en pathologische gelijkenissen met menselijke colitis ulcerosa, de dextran natrium (DSS) sulfaat-geïnduceerde IBD model heeft zijn meest gebruikte onder de verschillende chemisch geïnduceerde colitis modellen11. In deze studie gebruikten we α-gustducin-deficiënte muizen als een representatieve muis lijn te onthullen van de nieuwe functies van α-gustducin in de darm mucosale immuniteit en ontsteking door 1) analyseren morfologische veranderingen in het weefsel en 2) keuring van de verschillen in de expressie van cytokines gerelateerde tot ontsteking in de dikke darm. Deze methode kan worden gebruikt voor kwantitatief en kwalitatief bepalen de bijdragen van smaak signalering eiwitten (en andere eiwitten uitgedrukt in de darm) tot weefselschade en darmontstekingen, wanneer genetisch gemodificeerde muis voor de genen van lijnen belang zijn beschikbaar. Voordelen van deze methode zijn toelatend gebruikers om geïntegreerde gegevens als gevolg van acties van zowel de chemische DSS en tekort aan het gen van belang te verkrijgen. Deze methode kan verder worden verbeterd om te verhogen van de gevoeligheid en onthullen subtiele intestinale veranderingen op cellulair en moleculair niveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode kan worden gebruikt om te quantitively bepalen van het effect van mutaties van specifieke smaak genen op ontsteking in een muismodel van DSS-geïnduceerde IBD. U kunt optimaal profiteren, is optimale inductie van IBD een belangrijke stap. De ontwikkeling van colitis is beïnvloed door verschillende factoren, inclusief muis stam, huisvesting, milieu, intestinale microflora, evenals de genen van belang. Het is raadzaam voor het uitvoeren van een proefproject met een klein aantal muizen om te testen verschillen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de nationale natuurwetenschappen Stichting van China (81671016, 31471008 en 31661143030) en de National Institutes of Health (DC010012, DC015819) en door de Stichting Siyuan.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
