एक भड़काऊ आंत्र रोग माउस मॉडल में आंत सूजन पर संकेत प्रोटीन समाप्त होने के स्वाद के प्रभाव
Summary
यहां हम एक dextran सल्फेट सोडियम (DSS)-प्रेरित भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) माउस मॉडल में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर झोंका संबंधित जीन के nsa के प्रभाव की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) अल्सरेटिव कोलाइटिस और Crohn रोग, कि दुनिया भर में लाखों लोगों के जीवन की गुणवत्ता को प्रभावित करता है सहित प्रतिरक्षा संबंधी जठरांत्र विकारों में से एक है । आईबीडी लक्षण पेट में दर्द, दस्त, और मलाशय से खून बह रहा है, जो आंत microbiota, खाद्य घटकों, आंत्र उपकला कोशिकाओं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत से परिणाम हो सकता शामिल हैं । यह विशेष महत्व का आकलन करने के लिए कैसे प्रत्येक कुंजी जीन आंतों उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्यक्त की बृहदांत्र में सूजन को प्रभावित करता है । जी प्रोटीन-युग्मित स्वाद रिसेप्टर्स, सहित जी प्रोटीन उपइकाई α-gustducin और अन्य संकेतन प्रोटीन, आंतों में पाया गया है. यहां, हम एक प्रतिनिधि के रूप में α-gustducin का उपयोग करें और एक dextran सल्फेट सोडियम का वर्णन (DSS)-प्रेरित आईबीडी मॉडल आंत gustatory प्रतिरक्षा और सूजन पर श्लैष्मिक जीन उत्परिवर्तनों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए । इस विधि रासायनिक प्रेरित आईबीडी मॉडल के साथ जीन नॉकआउट प्रौद्योगिकी को जोड़ती है, और इस प्रकार के लिए gustatory जीन nsa के परिणाम का आकलन के रूप में अच्छी तरह से अंय जीन है कि exuberate या DSS-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पेट में गीला हो सकता है लागू किया जा सकता है । उत्परिवर्ती चूहों के दौरान एक निश्चित अवधि के लिए DSS के साथ प्रशासित कर रहे हैं, जो उनके शरीर के वजन, मल, और मलाशय से खून बह रहा निगरानी और दर्ज की गई. प्रशासन के दौरान अलग timepoints पर, कुछ चूहों euthanized हैं, तो आकार और उनकी तिल्ली और बृहदांत्र के वजन मापा जाता है और आंत के ऊतकों को एकत्र कर रहे हैं और ऊतकवैज्ञानिक और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए संसाधित. डेटा दिखाने के लिए कि α-gustducin नॉकआउट परिणाम अत्यधिक वजन घटाने, दस्त, आंत्र रक्तस्राव, ऊतक क्षति, और सूजन बनाम जंगली प्रकार चूहों । के बाद से प्रेरित सूजन की गंभीरता माउस उपभेदों, आवास पर्यावरण, और आहार, एक प्रायोगिक प्रयोग में DSS एकाग्रता और प्रशासन की अवधि के अनुकूलन से प्रभावित है विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इन कारकों का समायोजन करके, इस विधि दोनों विरोधी और समर्थक भड़काऊ प्रभाव का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), Crohn की बीमारी (सीडी), और अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) के दो प्रमुख रूपों जीर्ण remittent या multifactorial एटियलजि1,2 के साथ आंत के प्रगतिशील भड़काऊ स्थितियों की विशेषता है . आईबीडी के विकास पर निर्भर करता है आनुवंशिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ पर्यावरणीय कारकों जैसे आहार, एंटीबायोटिक का उपयोग करें, और महत्वपूर्ण बात, रोगजनक संक्रमण । हालांकि, एटियलजि और विनियामक आणविक तंत्र अंतर्निहित आईबीडी अभी भी अस्पष्ट हैं । इसलिए, कई रासायनिक प्रेरित आईबीडी पशु मॉडल का निर्माण किया गया है और रोगजनन और विनियामक तंत्र चित्रित और मानव चिकित्सकीय3की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए लागू होता है ।
स्वाद रिसेप्टर्स जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) कर रहे हैं और दो प्रमुख प्रकार के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं: प्रकार मैं (T1Rs), और प्रकार द्वितीय (T2Rs) कि मिठाई, उमामी, और कड़वा यौगिकों का पता लगाने. स्वाद संकेतन कैस्केडिंग tastant बाइंडिंग से T1Rs या T2Rs के द्वारा आरंभ किए जाते हैं, जो α-gustducin और एक Gβγ डिमर से मिलकर heterotrimeric G प्रोटीन को सक्रिय करते हैं और Gβγ उपइकाईयों को रिलीज़ करने के लिए अग्रणी होते हैं । बारी में Gβγ moiety बहाव प्रभाव एंजाइम phospholipase सी-β2 (पीएलसी-β2) को उत्तेजित करता है । सक्रिय पीएलसी-β2 तो hydrolyzes phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate दो intracellular माध्यमिक दूतों में [inositol-1, 4, 5-trisphosphate (आईपी3) और diacylglycerol], और आईपी3 बांध और अपने चैनल रिसेप्टर आईपी3 खोलने R3, endoplasmic जालिका से कैल्शियम आयनों जारी. यह अंततः क्षणिक रिसेप्टर संभावित आयन चैनल Trpm5 और gustatory नसों4,5,6,7पर न्यूरोट्रांसमीटर एटीपी के रिलीज के उद्घाटन की ओर जाता है. फिर भी, नमकीन और खट्टे स्वाद के संकेत रास्ते अलग और मिठाई, उमामी, और कड़वा8स्वाद से स्वतंत्र हैं । इसके अलावा, स्वाद GPCRs और बहाव प्रोटीन के घटक विभिंन अतिरिक्त मौखिक ऊतकों में मौजूद हैं । हाल के अध्ययनों से संकेत दिया कि α-gustducin, स्वाद संकेतन के प्रमुख घटक, आंतों की श्लेष्मा झिल्ली में व्यक्त किया जा पाया है । आगे के अध्ययन के लिए अतिरिक्त मौखिक ऊतकों9,10में इन स्वाद संकेत घटक के कार्यों को समझने की जरूरत है ।
विधि यहां वर्णित gustatory संकेत प्रोटीन अतिरिक्त मौखिक ऊतकों में व्यक्त की कार्यों की विशेषता के लिए प्रयोग किया जाता है । हम रासायनिक प्रेरित कोलाइटिस मॉडल के साथ स्वाद कलियों में delineating संकेतन झरने के लिए विकसित एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन गठबंधन । मोटे तौर पर मानव अल्सरेटिव कोलाइटिस के लिए अपनी प्रक्रियात्मक सादगी और रोग समानता के कारण, dextran सल्फेट सोडियम (DSS)-प्रेरित आईबीडी मॉडल सबसे व्यापक रूप से विभिन्न रासायनिक प्रेरित कोलाइटिस मॉडल11के बीच किया गया है । इस अध्ययन में, हम α-gustducin की कमी चूहों एक प्रतिनिधि माउस लाइन α के उपंयास कार्य-gustducin आंत श्लैष्मिक प्रतिरक्षा और सूजन में 1 से प्रकट करने के रूप में इस्तेमाल किया) ऊतक और 2 में रूपात्मक परिवर्तन का विश्लेषण) की अभिव्यक्ति में मतभेदों को परख साइटोकिंस बृहदांत्र में सूजन से संबंधित है । इस विधि को मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से gustatory संकेतन प्रोटीन के योगदान को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (और अंय प्रोटीन आंत में व्यक्त) ऊतक क्षति और आंत्र सूजन के लिए, जब आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों के जीन के लिए ब्याज उपलब्ध हैं । इस विधि के लाभ उपयोगकर्ताओं को एकीकृत दोनों रासायनिक DSS और ब्याज की जीन की कमी की क्रियाओं से जिसके परिणामस्वरूप डेटा प्राप्त करने के लिए सक्षम हैं । इस विधि को अपनी संवेदनशीलता बढ़ाने और सेलुलर और आणविक स्तर पर सूक्ष्म आंत्र परिवर्तन प्रकट करने के लिए आगे सुधार किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि quantitively एक DSS प्रेरित आईबीडी माउस मॉडल में सूजन पर विशिष्ट gustatory जीन के उत्परिवर्तन के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । पूरा लाभ लेने के लिए, आईबीडी की इष्टतम प्रेरण एक महत्वपू?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६७१०१६, ३१४७१००८, और ३१६६११४३०३०) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (DC010012, DC015819) और Siyuan फाउंडेशन द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
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