À l’aide de contenu élevé d’imagerie afin de quantifier l’Engagement de cibles en cellules adhérentes
Summary
Mesures de l’engagement de cibles de drogue sont au cœur de développement des médicaments efficaces et validation de la sonde chimique. Ici, nous détaillons un protocole permettant de mesurer l’engagement de drogue-cible à l’aide de l’imagerie contenu élevé dans une adaptation de microplaques compatibles de l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA).
Abstract
Quantifiant l’interaction des petites molécules avec la cible de leur protéine prévue est essentiel pour le développement de médicaments, de validation de cibles et de validation de la sonde chimique. Méthodes qui mesurent ce phénomène sans modification de la protéine ou les petites molécules sont particulièrement utiles, bien que techniquement difficile. L’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA) est une technique pour contrôler l’engagement cible dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici une adaptation du protocole CETSA original, qui permet pour les mesures de débit élevé tout en conservant la localisation sous-cellulaire au niveau de la cellule unique. Nous croyons que ce protocole offre des avancées importantes à l’application du CETSA caractérisation approfondie d’interaction composé-cible, notamment dans les populations hétérogènes de cellules.
Introduction
Lors de l’élaboration de nouveaux médicaments ou sondes chimiques, il est indispensable de coupler l’effet pharmacologique observé ou lecture fonctionnelle aux mesures de l’occupation de la cible ou l’engagement dans des cellules vivantes1,2,3. Ces données sont nécessaires pour s’assurer que la petite molécule a en effet atteint sa cible recherchée tant pour valider l’hypothèse biologique derrière la protéine cible sélection4,5. En outre, au cours du développement de médicaments, systèmes de modèles de complexité croissante servent à sélectionner et à corroborer un chef de file avant les essais cliniques. Pour confirmer la traduction de biologie dans l’ensemble de ces systèmes précliniques, les méthodes pour tracer les fiançailles de drogue-cible et accompagnant la biologie tout au long de ce processus de développement sont essentiels.
Engagement de drogue-cible est traditionnellement difficile à surveiller dans des cellules vivantes avec tétrahydrofuraniques de petites molécules et des protéines, notamment au niveau unicellulaire avec une résolution spatiale de6,7. Une méthode récente pour observer l’interaction entre tels quels médicaments et protéines dans des cellules vivantes est l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA) dans lequel stabilisation induite par le ligand d’une protéine native en réponse à un défi de chaleur est quantifiée8, 9,10. Ceci est accompli en quantifiant les protéines solubles restantes après exposition à une épreuve de la chaleur. Dans la notification initiale de CETSA, tache occidentale a été utilisée pour la détection. Pour activer les campagnes de dépistage et a frappé le triage des plus grandes collections de composés, efforts pour augmenter le débit de CETSA expériences ont conduit à l’élaboration de plusieurs essais homogènes, axée sur la microplaque10,11. Toutefois, une limitation avec ces méthodes est qu’elles sont actuellement mieux adaptées à un traitement composé des suspensions cellulaires et la détection exige la lyse cellulaire, conduisant à la perte de l’information spatiale. CETSA peut être appliqué expérimentalement soit comme un changement induite par le ligand température agrégation thermique (Ttot.) à une concentration unique de la petite molécule ou la concentration de ligand nécessaire pour stabiliser la protéine à une seule température. Ce dernier est appelé empreintes de réponse dose isotherme (ITDRF) pour signifier la dépendance à l’égard de ces mesures sur les conditions expérimentales spécifiques.
Le but du présent protocole est de mesurer l’engagement de cibles à l’aide de CETSA dans les cellules adhérentes de détection des anticorps par immunofluorescence (IF) avec la microscopie haute teneur12. Cette procédure s’étend la plate-forme CETSA originale permettant la quantification unicellulaire de l’engagement de cibles avec conservation de la localisation subcellulaire. En particulier, contrairement à nombreux rapports précédents, dans cette procédure composé traitement est effectué dans des cellules vivantes adhérentes sans détachement de surface ou de lavage avant le défi de la chaleur, afin de préserver l’équilibre de liaison établis que nous voulons mesurer13. Actuellement, la méthode est validée pour une cible protéine p38α (MAPK14) en plusieurs lignées de cellules, et nous espérons qu’en partageant cette procédure la technique peut être appliquée largement à travers la fusion proteome. Nous prévoyons que ce protocole peut être adaptée dans l’ensemble du pipeline de développement de drogue de dépistage, hit triage grâce au suivi de cible engagement in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tel que discuté dans la section résultats, il y a plusieurs étapes clés de la procédure. Tout d’abord, il est important d’identifier un réactif d’affinité de haute qualité. Nous vous recommandons une petite bibliothèque d’anticorps pour chaque cible souhaitée. Après qu’un anticorps primaire a été sélectionné, il est aussi important de valider le système pour un certain nombre de sites de liaison différents de la cible de la protéine, le cas échéant. Contre le dépistage des composés qui int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient soutien infrastructure Science for Life laboratoire et Karolinska Institutet. Les auteurs reconnaissent également l’entrée et discussions avec Michaela Vallin, Magdalena Otrocka et Thomas Lundbäck.
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
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