이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.
내 피 세포 (ECs) 제한 하거나 upregulated 인 프로 접착제 수용 체의 특징이 잘 캐스케이드를 통해 영향을 받는 조직으로 백혈구 신규 모집을 촉진 하 여 선 동적인 응답의 규칙에 대 한 필수적입니다에 염증 성 방 아 쇠에 따라 백혈구 세포 표면입니다. 과 선 동적인 응답 다 인구에 있는 개인 사이 유전 배경이 이러한 차이에 기여할 수 있다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 따라서 셀 유전자 id와 어떤 유전 이체의 무제한 소스 또는 기증자의 변이 나타내는 ECs (hiPSC-ECs)의 신뢰할 수 있는 원본으로 표시 되었습니다. hiPSC-ECs 따라서 기증자 특정 셀에 선 동적인 응답 모델링에 대 한 사용할 수 있습니다. 선 동적인 응답 생리 흐름 아래 hiPSC ECs에 백혈구 접착을 결정 하 여 모델링할 수 있습니다. 이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.
염증은 많은 병 적인 조건, 포함 심장 혈관 및 신경 퇴행 성 질환, 패 혈 증 및 불리 한 약물 응답 (ADRs)에서 중추적인 역할을 한다. 내 피 세포 (ECs) 전자 selectin, 세포 접착 분자 1 (ICAM-1) 등 혈관 세포 접착 분자-1 (VCAM-1) 그들의 표면에 프로 접착제 수용 체의 유도 통해 선 동적인 응답 조절에 필수적인 역 1 , 2. 다른 직물에 microvascular ECs 전시 선 동적인 응답3,4이 알려져 있습니다. 또한, 유전적 배경이 나 특정 유전 조건이 발생할 수 있습니다 개인; 염증 성 반응 차이 그러므로 다른 개인에서 ECs의 접근이 중요 하다. 최근, 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)5, 거의 모든 개인에서 파생 될 수 있는, 더 안정적이 고 재생 소스 ECs6,,78, 의 역할을 표시 했다 9. 따라서, 선 동적인 응답 및 hiPSC-ECs에 백혈구 신규 모집의 평가 뿐만 아니라 특정 유전 질환의 모델링을 위한 귀중 한 뿐만 아니라 간 개별 다양성의 표시를 제공 하 고를 위한 도구로 사용 하 맞춤된 의학 미래.
흐름 분석 공부 내 피 백혈구 상호 작용에 대 한 유용한 도구를 제공 합니다. 미세 장치에 진보 혈관 침대 전용 전단 응력 레벨의 정확한 제어와 생리 유체 흐름 조건의 재생산 가능 라이브 이미징 백혈구 캡처, 압 연, 크롤링, 접착 및 환생의 이벤트의 캐스케이드의 모니터링 가능 그러나 내 피-백혈구 상호 작용 연구를 몇 가지 흐름 분석 실험 개발 되었습니다, 그리고, 그들은 모두 기본 ECs10,11,,1213활용. 여기, 우리는 자세히 설명 hiPSC-ECs 생리 흐름 아래에 인간 백혈구 접착의 평가 대 한 분석 결과. 이 절차에서는 우리는 8 개의 병렬 채널 미세 칩에 시드 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα), 분리, 같은 프로-염증 성 자극으로 hiPSC EC 자극의 최적화 조건 설명 합니다. 우리는 미세 칩에 붙일 레이블된 백혈구 중단 hiPSC-ECs의 관류에 대 한 단계별 프로토콜을 설명 하 고, 라이브 셀 이미징 부착 백혈구의 계산 자동화.
이 프로토콜은 hiPSC-ECs 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 개인된 재생 의학에에서 선 동적인 응답의 평가 대 한 유용 합니다.
이 프로토콜 hiPSC EC 치료 프로-염증 성 자극, TNFα, hiPSC-ECs 라이브 이미징 및 부착 백혈구의 자동화 된 계산을 사용 하 여 흐름 분석 결과에서 백혈구 접착의 기능 평가 등의 특성을 설명 합니다.
HiPSC-ECs TNFα와의 하룻밤 자극 길쭉한 모양을 일반적으로 ECs에서 활성화 된 프로-염증 성 표현 형을 나타내는 결과. 최적화 단계 식 수준의 전자 selectin, ICAM-1, VCAM 1 FACs7,8, 그리고 기본 인간 탯 줄 정 맥 ECs (HUVECs)에 의해 확인 되어야 한다는 긍정적인 컨트롤로 포함 되어야 하는 것이 좋습니다.
최적의 hiPSC-ECs 분리 및 밀도 시드 confluent 단층 세포 덩어리를 형성 하지 않고 달성 하 고 나 막 신 채널을 도달 한다. 그것은 다시 중단 백혈구 직전 관류 셀 강 수를 방지 하 고 각 채널을 시 금 때 일정 농도 유지 하는 중요 한. 인간 주변 혈액 백혈구, monocytes, 호 중구 등 사용할 수 있습니다, 또는 THP-1 또는 HL-60 대 안으로 사용 될 수와 같은 monocytic 세포 라인을 설립.
미세 설정의 어셈블리 그리고 흐름 분석 결과, hiPSC-ECs 부착 백혈구의 분리 될 수 있습니다으로 미세 튜브와 채널에 갇혀에서 기포를 방지 하기 위해 중요 하다. 액체-액체 인터페이스 또는 미세 설정의 준비 하는 동안 추가 세척 단계 관 기포를 방지 하기 위해 도울 수 있었다.
그것은 프로토콜 어디 하나 셀을 준비 하 고 두 번째 준비 미세 시스템 및 흐름 분석 결과 두 연산자에 의해 실행 되는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 ECs는 처리 하기 전에 일정 시간 창 내에서 미세 칩으로 도금 및 정확성과 결과의 재현성을 향상 시킵니다. 또한,이 또한 멀게 실험 결과에서 바이어스를 방지 하려면 설정을 수 있습니다.
자동화 이미지 처리 파이프라인으로 성공적인 셀 검출, 높은 신호 대 잡음 비율 초점에서 이미지 하 고 셀 덩어리 같은 일반적인 개체의 autofluorescence를 피하기 위하여 중요 하다. 중요 한 중요성 확인 될 필요가 있는 부착 백혈구의 전형적인 크기의 최소 및 최대 한계의 정확한 사양이 이다. 하나 ImageJ의 선 측정 도구를 사용 하 여 백혈구의 일반적인 크기를 예측할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 분석에서 우리는 10.3-17.1 µ m (그림 4C)의 실제 크기에 해당 하는 9-15 픽셀의 범위를 사용. 잘못 된 범위, 예를 들어, 3-15 픽셀 (3.4-17.1 µ m)를 사용 하는 경우 단일 백혈구 하나의 셀으로 식별 됩니다 하지만 오히려 그 분할할 별도 개체 (그림 4D)로 식별 됩니다. 이것은 개체의 잘못 된 번호를 식별할 수 있습니다.
많은 개체의 낮은 강도 및 작은 표면 지역 보다 백혈구 제공된 적응형 임계 처리 방법을 사용 하 여 검색 될 수 있습니다. 이 때문에 autofluorescence 또는 다른 일반적인 형광 신호를 걸릴 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 일반적인 개체, 그들의 지역 단일 백혈구의 일반적인 영역 보다 작은 경우 필터링 수 있습니다 최소 허용된 표면 영역 (그림 4C)를 정의 하 여.
여기에 설명 된 흐름 분석 결과 수 elucidating이 두 세포의 상호 작용 하는 EC 단층에 백혈구 접착의 직접 평가 유형, 하지만 다른 세포 유형, pericytes는 혈관 벽에 존재와 같은 및 또한 수를 고려 하지 않습니다. 백혈구 넘쳐 흐름15의 규정에 참여 합니다. 다른 세포 유형 3 차원 문화 microenvironment 통합 시스템의 생리 적인 관련성 향상 시킬 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 여기에 설명 된 선 동적인 응답의 평가 대 한 흐름 분석 결과 제공 합니다 유용한 도구 기본 특성 및 질병에 대 한 hiPSC-ECs의 모델링 응용 프로그램을.
The authors have nothing to disclose.
저자는 다음 보조금을 인정 하 고 싶습니다: 유럽 연구 위원회 (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); 네덜란드 기관-온-칩 이니셔티브, 교육, 문화 및 과학 네덜란드 (024.003.001)의 정부에 의해 투자 하는 NWO 중력 프로젝트.
Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
Name | Company | Software version | Comments |
Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |