Her vi beskriver en klinisk relevant, høj effektivitet, feeder-fri metode til at omprogrammere menneskelige primære fibroblaster til induceret pluripotente stamceller ved hjælp af modificerede mRNAs kodning omprogrammering faktorer og modne mikroRNA-367/302 efterligner. Også inkluderet er metoder til at vurdere omprogrammering effektivitet, Udvid klonede iPSC kolonier, og bekræfte udtryk pluripotency mærkestof TRA-1-60.
Induceret pluripotente stamceller (iPSCs) har vist sig for at være et værdifuldt redskab til at studere menneskelig udvikling og sygdom. Yderligere fremme iPSCs som en regenerativ terapeutiske kræver en sikker, robust, og hensigtsmæssig omprogrammering protokol. Vi præsenterer her, en klinisk relevant, trinvise protokol for den ekstremt høj effektivitet omprogrammering af human dermal fibroblaster i iPSCs ved hjælp af en ikke-integration tilgang. Kernen i protokollen består af udtryk pluripotency faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) fra in vitro- transskriberede messenger RNA’er syntetiseret med modificerede nukleotider (modificeret mRNAs). De omprogrammering modificerede mRNAs er transfekteret i primære fibroblaster hver 48 timer sammen med modne embryonale stamceller-specifikke microRNA-367/302 efterligner for to uger. De resulterende iPSC kolonier kan så isoleret og direkte udvidet i feeder-fri betingelser. For at maksimere effektiviteten og sammenhængen i vores omprogrammering protokol over fibroblast prøver, vi har optimeret forskellige parametre, herunder RNA Transfektion regime, timing af transfections, dyrkningsbetingelserne og seeding tætheder. Vigtigere, genererer vores metode høj-kvalitets iPSCs fra de fleste fibroblast kilder, herunder vanskeligt at omprogrammere syge, ældre og/eller senescent prøver.
Omprogrammering somatiske celler til induceret pluripotente stamceller (iPSCs) kræver udvidet udtryk af et kernesæt af transkriptionsfaktorer, der er vigtige for opretholdelsen af pluripotency1,2. Når producerer iPSCs til kliniske anvendelser, er det vigtigt, at den mutationsmønstre byrde i inputcellerne minimeres under behandling og effektiviteten af iPSC generation er fastholdt på et relativt højt niveau på tværs af patientprøver. Men størstedelen af omprogrammering metoder, herunder integration-frie protokoller, lider af meget lavt omprogrammering effektivitetsfordele, som grænse kliniske anvendelighed af disse nærmer sig3. Den lave omprogrammering effektivitet kan også fremme selektive omprogrammering af celler transporterer forudbestående mutationer, øge mutationsmønstre byrde i resulterende iPSCs. Derudover lider alle DNA-baserede omprogrammering metoder såsom lentivirus – og episomal-baserede tilgange, af sikkerhed angå at DNA tilfældigt kan integrere i genomet og skabe mulighed for skadelige pattedyrsceller mutagenese og uønskede ( potentielt muterede) udtryk pluripotency gener i downstream væv derivater4.
En lovende metode til at opnå effektiv induktion af pluripotency i somatiske celler og reducere mutationsmønstre byrde i resulterende iPSCs er at bruge syntetiske udjævnede messenger RNA’er indeholdende modificeret nucleobases (modificeret mRNAs) til omprogrammering af5. Effektiviteten af modificerede mRNA-baserede omprogrammering tilgange kan styrkes yderligere ved at tilføje embryonale stamceller (ESC)-specifikke MicroRNA (miRNAs)-367/302s3, som har vist sig at omprogrammere somatiske celler med øget effektivitet6 ,7. Men selv med tilføjelsen af miRNAs-367/302s, den modificerede mRNA-baserede omprogrammering tilgang ofte mislykkes under ansøgning til frisk isoleret patient celler3. Til adresse uoverensstemmelser af denne ændrede mRNA-baseret tilgang, har vi for nylig rapporteret en optimeret, integration-gratis strategi, der inducerer pluripotency i menneskelige primære fibroblaster med en høj succesrate og udnytter begge modificerede mRNAs kodning omprogrammering faktorer og modne miRNA-367/302 efterligner8. I vores metode omfatter den omprogrammering modificerede mRNA cocktail en modificeret version af OCT4 sammenvokset med MyoD transactivation domæne (kaldet M3O)9 og fem andre omprogrammering faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A og NANOG). Kombinerer den modificerede mRNA kodning pluripotency faktorer med miRNA syntes efterligner at have en synergistisk effekt på omprogrammering effektivitetsgevinster i denne protokol. Yderligere optimeringer af RNA Transfektion regime, celle såning, og dyrkningsbaserede betingelser var også nødvendigt at øge omprogrammering effektiviteten af tilgang til en ultra-høj niveau8.
I modsætning til mange andre protokoller kræver vores omprogrammering tilgang typisk kun et par tusinde input fibroblaster. Derudover indebærer mange fælles ikke-integrere strategier via episomal plasmider, Sendai virus eller selvkopierende RNA, omfattende passaging for at fortynde den omprogrammering vektor i genererede iPSCs. Omvendt, modificerede mRNA og modne miRNA efterligner har en kort halveringstid og er hurtigt elimineret fra celler. Tilsammen, er mængden af kumulative celle kultur tid mellem indsamling patientprøver og generation af brugbare iPSCs minimal i denne tilgang, effektivt begrænser mutation ophobning i resulterende iPSCs og forbedre omkostningseffektiviteten.
Vi præsenterer her, den detaljerede trinvise protokol for at opnå høj effektivitet omprogrammering af voksne humane fibroblaster i iPSCs ved hjælp af vores kombinatorisk modificerede mRNA/miRNA-baseret tilgang8. RNA-baserede omprogrammering protokollen giver en enkel, omkostningseffektiv og robust metode til at generere integration-fri iPSCs for forskning og potentiale kliniske applikationer. Derudover er det relevant at omprogrammering af en bred vifte af fibroblast linjer herunder vanskeligt-at-Arbejd, sygdom-associerede, alderen, og senescent fibroblaster. En skematisk af protokollen for omprogrammering humane fibroblaster er vist i figur 1. Protokollen beskriver specifikt en metode til omprogrammering af tre wells af menneskelige voksen primære fibroblaster i en 6-godt format plade. To brønde give typisk et tilstrækkeligt antal kvalitets iPSC kolonier. I mange tilfælde kun én er godt nødvendig, og tredje godt kan bruges til analyse af omprogrammering effektivitet. Hvis det er påkrævet, kan antallet af brønde skaleres.
Denne protokol beskriver en klinisk relevant, ikke-integrering, RNA-baserede metode, der giver mulighed for omprogrammering af normale og sygdom-associerede menneskelige fibroblast linjer i iPSCs på en ultra-høj effektivitet. Til dato har har alle menneskelige fibroblast linje har vi forsøgt at omprogrammere med den beskrevne protokol givet et tilfredsstillende antal højkvalitets iPSCs for efterfølgende ansøgninger. Resulterende iPSCs kan umiddelbart overføres og udvidet i feeder-fri kultur betingelser.
Kvaliteten af fibroblaster til omprogrammering af:
Omprogrammering succes er stærkt afhængig af kvaliteten af starter fibroblaster. Ideelt set bør omprogrammering indledes med de laveste passage fibroblaster tilgængeligt til at opnå den højeste effektivitet. Omprogrammering effektivitet er bedst med fibroblaster af passage 2-4. Omprogrammeringen kan stadig arbejde med high-passage (passage 5-8), selv senescent fibroblaster, omend med en reduceret effektivitet. Sommetider lav-passage fibroblaster er ikke tilgængelig eller patientprøver har en genetisk mutation, der forhindrer sund vækst. I dette tilfælde, kan optimering af indledende plating tæthed være påkrævet. Omprogrammering af kompromitterede fibroblast linjer er normalt forbundet med øget celledød i RNA transfections. Som et resultat, vil celler i den omprogrammering godt synes at være sparsom med dage 10 – 14 af omprogrammering. Store acellulær områder vil også være synlige i brønden. Hvis dette er tilfældet, skal omprogrammering protokollen være igen indledte med en højere indledende startnummer af fibroblaster. Plating 3.000 inputceller pr. brønd af et 6-godt format parabol virker konsekvent for de fleste voksne fibroblast linjer. Imidlertid kan øge plating antallet til 5.000 – 10.000 (50.000 for senescent linjer) bidrage til at forbedre omprogrammering af sygdom-associerede prøver, som er blevet rapporteret i vores tidligere publikation8. Omvendt, celler at nå confluency for tidligt kan også blive resistente over for omprogrammering. Hvis celler gennemgår transfections med omprogrammering RNA’er formere sig for hurtigt (som undertiden er tilfældet med primære neonatal fibroblaster), indleder omprogrammering med 500 fibroblaster pr. brønd af et 6-godt format parabol8.
Håndtering af Transfektion buffer:
PH af Transfektion buffer (nedsat serum medium justeres til pH i 8.2) er altafgørende for at opnå de optimale Transfektion effektivitetsfordele kræves for denne omprogrammering protokol. Derfor anbefales flere forholdsregler vedrørende håndtering af Transfektion buffer. Vi har fundet, at selv korte eksponering Transfektion buffer for atmosfærisk luft påvirker pH i bufferen. Transfektion buffer bør derfor aliquoted i et skruelåg beholder med minimal luft rum (vi bruger enten 5 eller 15 mL skruelåg koniske rør). For at reducere yderligere luft eksponering, skal du bruge hver Transfektion buffer alikvot for højst to transfections. Endelig siden temperatur virkninger pH er det kritisk at Transfektion buffer er ekvilibreres til RT til montering af Transfektion komplekser. Det tilrådes at ikke varme Transfektion buffer til 37 ° C.
Passaging af iPSCs:
Mens mange tidligere offentliggjorte protokoller anbefale plukke enkelte iPSC kolonier i slutningen af omprogrammering, dette kan være vanskeligt at opnå, når effektiviteten af omprogrammering er meget høj, eller hvis kolonierne klynge sammen, som det ofte er tilfældet i vores protokol. Hvis iPSC kolonier i umiddelbar nærhed af hinanden, anbefaler vi derfor først passaging celler til at sprede ud omprogrammeret iPSCs før manuelt picking kolonier. Der er flere fordele ved at udføre trinnet tidlige passage. Breder sig ud i kolonier giver dem mere plads til at vokse, hvilket giver meget større kolonier til pluk end ellers kunne være opnået i den oprindelige godt. Dette forbedrer succesrate i at etablere en iPSC linje fra en plukket klon. Vi finder også, at yderligere kultur tid med fibroblaster, omend på en fortyndet ratio, vises den gennemsnitlige kvalitetsforbedring af plukkede iPSC kolonier. Ufuldstændigt omprogrammeret fibroblaster kan give understøttende paracrine faktorer, som fortsat vil hjælpe med at etablere iPSCs og lette den direkte overgang til feeder-gratis celle kultur betingelser. Fibroblaster har tilfældigvis en selektiv vækst ulempe i forhold til iPSCs når kulturperler i mTeSR1. Derfor, kontaminerende fibroblast cellen befolkningen hurtigt fortyndes til ubetydelige mængder inden for 3-4 passager.
ROCK hæmmere såsom Y-27632 anvendes ofte til rutinemæssig kultur af menneskelige iPSCs. Vi har fundet, at hyppige og/eller udvidet kultur af nogle iPSC linjer med Y-27632 kan have skadelige virkninger på overordnede kvalitet. Når du bruger en klump passaging metode, er som med EDTA, Y-27632 ikke nødvendigt at bevare iPSC levedygtighed efter opdeling. Vi har fuldstændig elimineret supplerende medier med Y-27632 til alle iPSC isolation, udvidelse eller rutinemæssig kultur.
Protokollens begrænsninger:
Én begrænsning for den beskrevne RNA-baserede omprogrammering tilgang er indledende omkostningerne og kompleksiteten forbundet med udarbejdelsen af de omprogrammering reagenser. Selv om forberedende procedurer til at generere mRNA reagenser er alle rutine og tidligere har været beskrevet (PCR, in vitro- transskription, DNase behandling, udjævningen, dephosphorylation, rensning), er kumulativt produktion af mRNA reagenser en forholdsvis lange og ikke-triviel proces. Den anden store udfordring i denne protokol er behovet for at transfect celler hver 48 h, øge labor intensiteten af omprogrammering protokollen. Disse overvejelser kan være uoverkommelige hvis omprogrammering af kun et par patientprøver ønskes. Men hvis de primære overvejelser er generation af klinisk relevante iPSCs eller meget høj omprogrammering effektivitet, den beskrevne RNA-baserede omprogrammering tilgang er ideel.
Sammenfattende afhænger beskrevet højeffektiv RNA-baserede omprogrammering metoden af optimeret Transfektion effektivitet af typen somatisk skal omprogrammeres som beskrevet i vores tidligere publikation8. RNA Transfektion protokollen præsenteret i denne undersøgelse er meget indstillet til menneskelige primære fibroblaster men kan potentielt være skræddersyet til andre celletyper effektivitetsforbedringerne omprogrammering af forskellige somatiske celler.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for finansiering støtte fra National Institutes of Health (T32AR007411-33) og University of Colorado hud sygdomme forskning Core Center (P30AR057212). Vi takker også de Epidermolysis Bullosa (EB) forskningspartnerskab, EB Medical Research Foundation, kur EB velgørenhed, dystrofe Epidermolysis Bullosa Research Association (DEBRA) International, Koning Boudewijn-Stichting Vlinderkindje fond, og låger Grænser fond.
Plasmid templates for PCR | |||
pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
(ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
DNase I | NEB | M0303S | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
Fibroblast culture and reprogramming | |||
0.1% Gelatin in H2O | stemcell technologies | #07903 | |
Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
iPSC culture | |||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
Antibodies and Detection | |||
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
Special Equipment | |||
Description | Notes | ||
Biological safety cabinet | |||
Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37°C. | ||
Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37°C. Use for the reprogramming procedure. | ||
pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |