تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل
Summary
الجيش الملكي النيبالي/البروتين المجمعات تنقيته باستخدام استراتيجية ستريبتافيدين botin هي التيد للحل في ظل الظروف يشوه بشكل غير مناسب لمزيد من التنقية والتحليل الوظيفي. وهنا يصف لنا تعديل هذه الاستراتيجية التي تستخدم رابط صورة كليفابل في الجيش الملكي النيبالي، وخطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية لطيف، تسفر عن مجمعات الجيش الملكي النيبالي/البروتين الأصلي وتعمل بكامل طاقتها.
Abstract
لسنوات عديدة، استخدمت بنجاح قوية على نحو استثنائي وشكلت سرعة تفاعل البيوتين وستريبتافيدين لتنقية جزئية هامة بيولوجيا الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات. إلا أن هذه الاستراتيجية تعاني من عيب رئيسي واحد يحد من استخدامها الأوسع: تفاعل البيوتين/ستريبتافيدين يمكن كسرها إلا بمعرفة الظروف التي تعطل أيضا سلامة مجمعات الوتيد، ومن ثم تحول دون بهم تحليل وظيفي اللاحقة و/أو تنقية كذلك بطرق أخرى. وباﻹضافة إلى ذلك، العينات التيد غالباً ملوثة بالبروتينات الأساسية التي تربط نونسبيسيفيكالي بالخرز streptavidin، تعقيد تحليل المجمعات المنقي تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير البديل من البيوتين/ستريبتافيدين الاستراتيجية التي يتم إرفاق البيوتين الركيزة الحمض النووي الريبي عن طريق رابط صورة كليفابل ومجمعات معطلة على الخرز streptavidin هي التيد بشكل انتقائي للحل في النموذج الأصلي بموجة طويلة الأشعة فوق البنفسجية، تاركاً البروتينات الخلفية في الخرز. يمكن توليفها أقصر من ركائز ربط الحمض النووي الريبي كيميائيا مع البيوتين ورابط الصورة كليفابل تساهمي يعلق على نهاية 5 ‘ من الجيش الملكي النيبالي، بينما أطول الحمض النووي الريبي ركائز يمكن أن تقدمها مع الفريقين اليغنوكليوتيد تكميلية. تم اختبار هذه نوعين مختلفين من الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية U7 سنرنب-تعتمد على تجهيز المجمعات أن تنشق هيستون قبل-مرناس في نهاية 3 ‘ وكلاهما أثبت إيجابية مقارنة بأخرى قبل وضع أساليب تنقية. عينات التيد الأشعة فوق البنفسجية الواردة مبالغ سنرنب U7 التي كانت خالية من الملوثات الرئيسية البروتين ومناسبة للتحليل المباشر من الطيف الكتلي والاختبارات الوظيفية سهولة الاكتشاف. يمكن تكييفها لتنقية مجمعات ربط الحمض النووي الريبي الأخرى الأسلوب الذي وصف بسهولة واستخدامها بالاقتران مع مواقع مفرد، ومزدوج تقطعت الحمض النووي ملزم لتنقية البروتينات الخاصة بالحمض النووي ومجمعات الجزيئات.
Introduction
في حقيقيات النوى، يخضع السلائف مرناً ولدت الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (قبل-مرناس) عدة أحداث نضج في النواة قبل أن تصبح قوالب مرناً تعمل بكامل طاقتها تخليق البروتين في السيتوبلازم. واحد من هذه الأحداث نهاية تجهيز 3 ‘. للغالبية العظمى من قبل-مرناس، تتضمن 3 ‘ المعالجة نهاية الانقسام بالإضافة إلى بوليادينيليشن. هذا رد فعل خطوتين هو تحفزها وفيرة نسبيا معقدة تتألف من أكثر من 15 البروتينات1. معالجة ما قبل الحيوانية المعتمدة على النسخ المتماثل هيستون-مرناس في نهاية 3 ‘ بواسطة إليه مختلفة التي الدور الرئيسي الذي تؤديه سنرنب U7، وفرة منخفضة معقدة تتألف من سنرنا U7 ~ 60 النيوكليوتيدات والبروتينات متعددة2،3 . زوج قاعدي سنرنا U7 مع تسلسل معين في هيستون قبل-مرناً وواحدة من الوحدات فرعية سنرنب U7 يحفز رد فعل الانقسام، وتوليد هيستون الناضجة ذيل مرناً دون poly(A). هيستون-مرناً قبل نهاية تجهيز 3 ‘ يتطلب أيضا حلقة الجذعية ملزمة البروتين (سلبب)، الذي يربط حلقة جذعية مصانة يقع المنبع لموقع الانقسام ويعزز تجنيد سنرنب U7 إلى الركيزة2،3. الدراسات الرامية إلى تحديد المكونات الفردية سنرنب U7 كانت صعبة بسبب تركيز منخفض من سنرنب U7 في الخلايا الحيوانية، واتجاه المجمع ننأى أو الخضوع proteolysis الجزئي أثناء تنقية نتيجة استخدام المنظفات خفيفة4،،من56ويغسل الملح عالية و/أو متعددة الخطوات الكروماتوغرافي7،،من89.
لتحديد تكوين الآلية U7-تعتمد على المعالجة، وكان المحتضنة جزء قصير من هستون مرناً قبل المحتوية على البيوتين في 3 أو 5 ‘ مع خلاصة نووية مؤخرا، وتم القبض على مجمعات المجتمعون في المغلفة ستريبتافيدين [اغروس] الخرز5،،من610. بسبب تفاعل قوية على نحو استثنائي بين البيوتين و streptavidin، الوتيد تحت يشوه الظروف من الغليان في الحزب الديمقراطي الصربي بروتينات معطلة على الخرز ستريبتافيدين وتحليلها بواسطة تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. بينما هذا النهج بسيطة حددت عددا من عناصر سنرنب U7، أسفرت عن عينات بدائية نسبيا، وغالباً ما تكون ملوثة بعدد كبير من البروتينات الخلفية نونسبيسيفيكالي ملزمة بالخرز ستريبتافيدين، يحتمل أن إخفاء بعض عناصر إليه معالجة ومنع الكشف عنها على الفضة الملون الهلام5،،من610. الأهم من ذلك، يمنع هذا النهج أيضا أي الدراسات الفنية مع المواد المعزولة وفي تنقية إضافية إلى التجانس بطرق إضافية.
واقترح عددا من التعديلات على مر الزمن لمعالجة الطبيعة تقريبا لا رجعة فيه تفاعل البيوتين/streptavidin، مع معظمهم ويجري تصميم أما يضعف التفاعل أو تقديم ذراع مباعدة كيميائيا كليفابل في المحتوية على البيوتين الكواشف11،12. وكان الجانب السلبي لجميع هذه التعديلات أنها تقلل إلى حد كبير كفاءة الأسلوب و/أو الشروط غير الفسيولوجية المطلوبة غالباً أثناء الخطوة شطف، يعرض للخطر سلامة أو نشاط البروتينات المنقاة.
وهنا يصف لنا مقاربة مختلفة لحل المشكلة الكامنة استراتيجية البيوتين/ستريبتافيدين باستخدام الحمض النووي الريبي نهاية ركائز التي أرفقت البيوتين تساهمي إلى 5 ‘ عبر ‘ 1 صور–كليفابل-(2-نيتروفينيل) moiety إيثيل هو حساسة للأشعة فوق البنفسجية13،14موجه طويلة. وقمنا باختبار هذا النهج لتنقية إليه تجهيز U7-تعتمد على الحد من المورفولوجية والثدييات النووية مقتطفات15. معطلة في الخرز streptavidin عقب حضانة قصيرة من هستون مرناً قبل المحتوية على البيوتين ورابط صور كليافابلي مع خلاصة نووية، مجمعات المعالجة المجمعة وغسلها جيدا وصدر برفق للحل في مسقط النموذج قبل التعرض للضوء ~ 360 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية. أسلوب الأشعة فوق البنفسجية-شطف جداً فعالة وسريعة وواضحة، مما أسفر عن كميات كافية من سنرنب U7 تصور مكوناته بالشظية تلطيخ من قدر ضئيل من 100 ميليلتر من استخراج15. المواد التيد الأشعة فوق البنفسجية خال من البروتينات أساسية ومناسبة لتحليل الطيف الكتلي المباشر وخطوات تنقية إضافية وفحوصات الانزيمية. قد اعتمدت نفس الأسلوب لتطهير المجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين الأخرى التي تتطلب مواقع ربط الحمض النووي الريبي قصيرة نسبيا. البيوتين ورابط الصورة كليافابلي يمكن أيضا تساهمي إرفاق إلى واحد-ومزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي، واحتمال توسيع نطاق الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية مختلف الحمض النووي/البروتين المجمعات.
التوليف الكيميائي للحمض النووي الريبي الركازات المحتوية على تساهمي تعلق البيوتين ورابط الصورة كليفابل العملي فقط مع تسلسل التي لا تتجاوز النيوكليوتيدات ~ 65، أصبحت مكلفة وغير فعالة لتسلسل أطول بشكل ملحوظ. ولمعالجة هذه المشكلة، وضعنا أيضا نهج بديل مناسب لأهداف ملزمة الحمض النووي الريبي أطول بكثير. في هذا النهج، والجيش الملكي النيبالي من أي طول والنوكليوتيدات تسلسل الذي تم إنشاؤه في المختبر بالنسخ T7 أو SP6 وتعتيق إلى اليغنوكليوتيد تكميلية قصيرة التي تحتوي على البيوتين ورابط الصورة كليفابل في 5 ‘ نهاية (ترانس التكوين). مزدوج الناتجة بعد ذلك، تستخدم لتنقية البروتينات الربط الفردي أو مجمعات الجزيئات في الخرز streptavidin بعد البروتوكول نفسه وصف لركائز الجيش الملكي النيبالي المحتوية على البيوتين كليفابل الصور المرفقة تساهمي (رابطة الدول المستقلة التكوين). مع هذا التعديل، يمكن استخدام البيوتين صور كليفابل بالاقتران مع في المختبر التي تم إنشاؤها بالنصوص التي تحتوي على مئات النيوكليوتيدات، توسيع نطاق الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية للتنقية لنطاق واسع من الجيش الملكي النيبالي/البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب الموصوفة هنا واضحة وإلى جانب إدراج رابط صورة كليفابل والأشعة فوق البنفسجية-شطف والخطوة لا تختلف عن الأساليب شيوعاً التي تستفيد من تفاعل قوي جداً بين البيوتين وستريبتافيدين. الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف فعال جداً، عادة الإفراج عن أكثر من 75% من الجيش الملكي النيبالي المعطل تداو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر زملائنا والمتعاونين على مساهمتهم لعملنا. أيد هذه الدراسة المعاهد الوطنية للصحة منح جنرال موتورز 29832.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d’Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3′ end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 ‘-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 ‘-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2′- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 ‘-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5′-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ‘ exonuclease that specifically interacts with the 3 ‘ end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3’hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3’hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3′ end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ‘ end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L’Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3′ end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
