Summary
Complejos de ARN/proteína purificados mediante estrategia de botín-estreptavidina se eluyen a solución bajo condiciones de desnaturalización en una forma inadecuada para la posterior purificación y análisis funcional. Aquí, describimos una modificación de esta estrategia que utiliza a un enlazador foto escindibles en RNA y un suave paso UV-elución, produciendo complejos de RNA/proteína nativas y completamente funcionales.
Abstract
Durante muchos años, la interacción excepcionalmente fuerte y rápidamente formada entre biotina y estreptavidina se ha utilizado con éxito para la purificación parcial de complejos RNA/proteína biológicamente importantes. Sin embargo, esta estrategia sufre una importante desventaja que limita su utilización más amplia: la interacción de la biotina/estreptavidina se puede romper solamente bajo desnaturalizar condiciones que también alteran la integridad de los complejos eluídas, de ahí que su Análisis funcional posterior y posterior purificación por otros métodos. Además, las muestras eluídas con frecuencia están contaminadas con las proteínas de fondo que un asocian con estreptavidina granos, que complica el análisis de los complejos purificados por plata y espectrometría de masas. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una variante de la estrategia de biotina/estreptavidina biotina se une a un sustrato de RNA mediante un enlazador foto escindibles y los complejos inmovilizados en cuentas de estreptavidina se eluyen selectivamente a la solución en un forma nativa por onda larga UV, dejando las proteínas de fondo en las cuentas. Cortos sustratos de enlace de RNA pueden ser sintetizados químicamente con biotina y el vinculador foto escindibles covalentemente atado extremo 5' del ARN, mientras que los dos grupos pueden proporcionar sustratos de RNA más largo por un oligonucleótido complementario. Estas dos variantes del método UV-elución fueron probadas para la purificación de los complejos de procesamiento de RNPnp dependiente U7 que cleave pre-mRNAs de las histonas en el extremo 3' y ambos probaron a comparar favorablemente con otros previamente desarrollado métodos de purificación. Eluyen de UV de las muestras contuvieron cantidades fácilmente detectables de la RNPnp U7 que era libre de contaminantes de la proteína importante y conveniente para el análisis directo por espectrometría y análisis funcionales. El método descrito puede ser fácilmente adaptado para la purificación de otros complejos de unión de la RNA y utilizado conjuntamente con sitios de unión de ADN de hebra simple y doble para purificar DNA específico proteínas y complejos macromoleculares.
Introduction
En eucariotas, precursores de ARN polimerasa II genera ARNm (pre-mRNAs) se someten a varios eventos de maduración en el núcleo antes de ser completamente funcional plantillas de mRNA para la síntesis de proteínas en el citoplasma. Uno de estos eventos es el 3' final de procesamiento. Para la mayoría de los pre-mRNAs, 3' extremo proceso de elaboración es escote juntada a poliadenilación. Esta reacción de dos etapas es catalizada por un complejo relativamente abundante que consta de más de 15 proteínas1. Histona dependiente de replicación animal pre-mRNAs se procesan en el extremo 3' por un mecanismo diferente en la que el papel es interpretado por U7 RNPnp, una abundancia baja compleja de U7 snRNA de ~ 60 nucleótidos y múltiples proteínas2,3 . El snRNA U7 de pares de bases con una secuencia específica de pre-mRNA de la histona y una de las subunidades de la U7 RNPnp cataliza la reacción de hendidura, generación madura histona mRNA sin un poly(A) cola. 3' procesamiento del pre-mRNA de la histona también requiere lazo del vástago vinculante proteínas (SLBP), que se une un conservado-lazo del vástago situado aguas arriba del sitio de clivaje y aumenta la contratación de la RNPnp U7 al substrato2,3. Estudios destinados a identificar los componentes individuales de la U7 RNPnp han sido difíciles debido a la baja concentración de la RNPnp U7 en las células animales y la tendencia del complejo disociar o experimentan proteólisis parcial durante la purificación como resultado del uso detergentes suaves4,5,6, lavados de sal alta o múltiples pasos cromatográficos7,8,9.
Recientemente, para determinar la composición de la maquinaria de procesamiento de U7-dependiente, un fragmento corto de la biotina que contiene de pre-mRNA de histona 3' o 5' fue incubado con un extracto nuclear y los complejos armados fueron capturados en recubiertas de estreptavidina perlas de agarosa5,6,10. Debido a la interacción excepcionalmente fuerte entre biotina y estreptavidina, proteínas inmovilizadas en perlas de estreptavidina fueron eluidas bajo desnaturalizar condiciones hirviendo en SDS y analizadas por plata y espectrometría de masas. Mientras que este enfoque simple identifica un número de componentes de la U7 RNPnp, rindió muestras relativamente crudas, a menudo contaminadas con un gran número de proteínas de fondo un limitado a cuentas de estreptavidina, potencialmente enmascarar algunos de los componentes de la maquinaria de procesamiento y evitar su detección en la plata mancharon geles5,6,10. Lo importante, este enfoque también imposibilitó cualquier estudios funcionales con el material aislado y su posterior purificación a homogeneidad por otros métodos.
Se propusieron una serie de modificaciones con el tiempo para abordar la naturaleza prácticamente irreversible de la interacción de la biotina/estreptavidina, con la mayoría de ellos están diseñados para debilitar tanto la interacción o para proporcionar un brazo espaciador químicamente escindibles en la biotina-contener reactivos11,12. La desventaja de estas modificaciones fue que reducen significativamente la eficiencia del método o condiciones no fisiológicas a menudo requeridas durante la etapa de elución, poniendo en peligro la integridad o la actividad de las proteínas purificadas.
Aquí, describimos un enfoque diferente para resolver el problema inherente de la estrategia de biotina/estreptavidina utilizando RNA sustratos que biotina se une covalentemente a los 5' extremo a través de una foto escindibles 1-(2 nitrofenil) molécula de etilo que es sensible a la onda larga UV13,14. Hemos probado este enfoque para la purificación de la maquinaria de procesamiento de U7-dependiente limitante de Drosophila y mamíferos nuclear extractos de15. Tras una breve incubación de biotina que contiene de pre-ARNm de histonas y el vinculador foto divisible con un extracto nuclear, los complejos de procesamiento montado son inmovilizados en perlas de estreptavidina, bien lavados y lanzó suavemente a la solución en un nativo se forman por la exposición a la luz de ~ 360 nm UV. El método de elución de la UV es muy eficiente, rápido y sencillo, produciendo una cantidad suficiente de la RNPnp U7 para visualizar sus componentes por astilla, manchas de tan poco como 100 μl del extracto de15. El material eluyó UV está libre de proteínas del fondo y adecuado para el análisis de espectrometría de masas en directo, pasos de purificación adicionales y ensayos enzimáticos. Se puede adoptar el mismo método para la purificación de otros complejos de RNA/proteína que requieren relativamente pocos sitios de unión de la RNA. Biotina y el vinculador foto escindibles pueden también covalente sujetarse a solo - y doble cadena ADN, potencialmente extender el método de elución de UV para la purificación de diversos complejos DNA/proteína.
Síntesis química de sustratos de RNA que contienen covalentemente había unido a biotina y el vinculador foto escindibles es práctico solamente con las secuencias que no superan los nucleótidos ~ 65, ser costoso e ineficiente para secuencias mucho más largas. Para solucionar este problema, también hemos desarrollado un enfoque alternativo que es conveniente para más objetivos vinculantes de RNA. En este enfoque, ARN de cualquier secuencia de la longitud y el nucleótido es generada en vitro por transcripción T7 o SP6 y recocido a un corto oligonucleótido complementario que contiene biotina y el vinculador foto escindibles en el extremo 5' (trans configuración). Dúplex resultante posteriormente es utilizado para purificar proteínas individuales o complejos macromoleculares en granos de estreptavidina siguiendo el mismo protocolo descrito para los sustratos de RNA que contienen biotina foto escindibles unida covalentemente (cis configuración). Con esta modificación, la biotina foto escindibles puede utilizarse en conjunción con en vitro generadas las transcripciones que contienen cientos de nucleótidos, que se extiende el método de elución de UV para la purificación de una amplia gama de RNA/proteína.
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Protocol
1. preparación del sustrato
Nota: Sustratos de RNA menos de ~ 65 nucleótidos pueden ser sintetizados químicamente con biotina (B) y el vinculador foto escindibles (pc) (conjuntamente denominado foto escindibles biotina o pcB) covalentemente unida al RNA 5' final (configuracióncis ). Sustratos de RNA que contiene significativamente más sitios de Unión deben ser generados en vitro por transcripción T7 (o SP6) y posteriormente recocido a un oligonucleótido corto adaptador complementario que contiene la molécula de pcB en el extremo 5' (trans configuración) (figura 1).
- Para sitios de unión de nucleótidos menos de ~ 65, un fabricante comercial (Tabla de materiales) para sintetizar químicamente RNA de interés con pcB covalentemente unida al RNA 5' final (figura 1A y figura 2A). Disolver en agua estéril para alcanzar la concentración deseada y guardar en pequeñas alícuotas a-80 ° C.
- Sitios de Unión significativamente más de ~ 65 nucleótidos, forma un dúplex parcial de una en vitro genera RNA de interés y un oligonucleótido de adaptador complementario que contiene la molécula de pcB en el extremo 5' (Figura 3A).
- Realizar T7 transcripción en el ADN de un plásmido linearizado o una adecuada plantilla de polimerización en cadena para generar RNA con el sitio de unión de interés extendido en el extremo 3' una secuencia arbitraria de ~ 20 nucleótidos.
- Utilice un fabricante comercial (Tabla de materiales) para sintetizar químicamente un oligonucleótido de adaptador que es complementario a la extensión 3' del RNA T7-generado y contiene pcB en el extremo 5' (Figura 3A).
Nota: Dos espaciadores de átomo de 18 y 2-3 nucleótidos no complementarios pueden colocarse en el extremo 5' de los oligonucleótidos para reducir potencial impedimento estérico entre el complejo encuadernado y granos de estreptavidina. También es deseable que el oligonucleótido uniformemente es modificado con un grupo 2' O-metílico para aumentar la fuerza de lo duplex y para proporcionar resistencia contra varias nucleasas. - Recueza el RNA T7-generado para el pcB adaptador de oligonucleótidos.
- Mezcla 20 pmol del ARN y 100 pmol de los oligonucleótidos de pcB de adaptador (cociente molar de 1:5) de 1,5 mL conteniendo 100 μl de tampón de unión con la siguiente composición del tubo: 75 mM KCl, pH de 15 mM HEPES 7.9, 15% de glicerol, ácido de 10 mM etilendiaminotetracético (EDTA).
Nota: Es importante utilizar una cantidad mínima de los oligonucleótidos de adaptador que son suficiente para formar un duplex con la mayoría (si no todos) sustrato de pre-mRNA utilizado en la reacción de recocido. Esto podría ser convenientemente determinado por etiquetado sustrato de RNA en el extremo 5' con 32P, recocido del sustrato marcado con cantidades crecientes de la utilización de oligonucleótidos adaptador varios buffer condiciones y control de la retención de la señal radiactiva estreptavidina granos después de varios lavados de los granos con el tampón de Unión. - Coloque el tubo en agua hirviendo durante 5 minutos.
- Permitir que el agua se enfríe a temperatura ambiente.
- Mezcla 20 pmol del ARN y 100 pmol de los oligonucleótidos de pcB de adaptador (cociente molar de 1:5) de 1,5 mL conteniendo 100 μl de tampón de unión con la siguiente composición del tubo: 75 mM KCl, pH de 15 mM HEPES 7.9, 15% de glicerol, ácido de 10 mM etilendiaminotetracético (EDTA).
2. complejo conjunto
- Suplemento 1 mL de un extracto nuclear del ratón (o de otro Extracto de elección) con pH del EDTA de 80 mM 8 a una concentración final de 10 mM para bloquear nucleasas de metal-dependiente no específicas que están presentes en el extracto.
Nota: Esto dará lugar a ajuste de amortiguador en el extracto de la misma composición que en el tampón de unión (ver paso 1.2.3.1). EDTA no afecta en vitro el procesamiento de los pre-mRNAs de histonas pero puede ser perjudicial en la purificación de proteínas o complejos proteicos que montan en una forma dependiente de magnesio. En estos casos, debe evitarse EDTA. - Añadir 5-10 pmol de sustrato RNA etiquetado con la molécula de pcB en cis (ver paso 1.1) o trans (ver paso 1.2.3.3) a 1 mL del extracto que contiene 10 mM EDTA.
Nota: La cantidad de ARN debe ser evaluados cuidadosamente en una serie de experimentos de prueba. Utilizando demasiado sustrato de RNA para la purificación de un complejo limitando tal vez contraproducente, aumentando significativamente el fondo de proteínas no específicas de RNA sin tener ningún efecto sobre la producción de proteínas específicas. - Incubar el substrato del RNA con el extracto durante 5 minutos en hielo, de vez en cuando mezcla la muestra.
Nota: Tanto el tiempo y la temperatura de la incubación se necesitan establecer empíricamente y pueden variar significativamente, dependiendo de la naturaleza específica del complejo ARN/proteína. - Girar la mezcla de incubación en una microcentrífuga previamente enfriada durante 10 min a 10.000 x g para eliminar cualquier potencial precipitados y recoger con cuidado el sobrenadante evitando la transferencia del balín.
3. inmovilización de los complejos de RNA/proteína en granos de estreptavidina.
- Transferencia de ~ 100 μl de suspensión de grano de agarosa de estreptavidina de un proveedor comercial (Tabla de materiales) a un tubo de 1,5 mL y aumentar el volumen con el tampón de unión (75 mM KCl, pH de 15 mM HEPES 7.9, glicerol al 15%, 10 mM EDTA).
Nota: Este buffer debe tener la misma composición que la mezcla de recocido y el extracto utilizado para el montaje complejo (paso 2.1). - Recoger los granos en la parte inferior del tubo de spinning durante 2-3 min a 25 g de x y aspirar el sobrenadante.
- Repita el mismo procedimiento de lavado/spinning 2 - 3 veces a que se equilibren las cuentas con el tampón de Unión.
Nota: Al final de este paso, el sedimento de los granos debe tener un volumen de ~ 30 μl. - Cargar el sobrenadante que contiene el complejo montado (paso 2.4) sobre las perlas de agarosa estreptavidina equilibrado.
- Gire 1 h a 4 ° C para inmovilizar RNA y los complejos enlazados en las cuentas.
- Recoger los granos en la parte inferior del tubo de spinning durante 2-3 min a 25 g de x.
Nota: Utilice un rotor batiente para evitar pérdida sustancial de los granos tienden a adherirse a la pared del tubo en rotores angulares. - Aspirar el sobrenadante y lavar los granos dos veces con 1 mL de la solución de enlace, usando las mismas condiciones de centrifugación.
- Añadir 1 mL de la solución de fijación y gire la muestra 1 h a 4 ° C.
Nota: Este paso puede ser acortado si el complejo que se forma sobre el sustrato tiende a disociar. - Desactivación de los granos para 2-3 min a 25 g de x, añadir 1 mL de la solución y transfiera la suspensión a un tubo nuevo.
- Gire para un adicional 1 h o menos, si el complejo no es estable, desactivación durante 2-3 min a x 25 g y transferir los granos a un tubo 500 μL en 200 μL de tampón de Unión.
4. UV-elución.
- Encienda una lámpara UV que emite luz ultravioleta de 365 nm durante 5-10 min antes de alcanzar brillo completo de alta intensidad.
Nota: Esto es esencial para alcanzar la energía máxima de emisión de UV en el inicio de la irradiación. - Llenar el fondo de un plato de Petri (100 x 15 mm) con hielo apretada y apilarlo sobre tapa el plato.
- Brevemente vortex el tubo que contiene el complejo inmovilizado, coloque horizontalmente en el hielo y cubierta con la lámpara precalentada, asegurando que la muestra se encuentra dentro de la distancia de 2-3 cm de la superficie de la bombilla.
Nota: Si la distancia es demasiado grande, uso adicional de Petri u otros objetos adecuados para hacer la muestra más cerca de la bombilla. - Irradiar para un total de 30 min, invertir con frecuencia y de Vortex el tubo para asegurar una exposición uniforme de la suspensión a los rayos UV y para evitar el sobrecalentamiento.
Nota: Para proporcionar refrigeración adicional, el paso de rayos UV-elución puede llevarse a cabo en una cámara fría. Cambiar a una placa Petri con hielo fresco en caso de fusión de hielo excesiva. - Desactivación de los granos para 2-3 min a 25 x g y recoger el sobrenadante.
- Volver a girar el sobrenadante utilizando las mismas condiciones y recoger el sobrenadante.
Nota: Dejar una pequeña cantidad de sobrenadante en la parte inferior para evitar la transferencia de granos residuales.
5. análisis por tinción de plata seguida de espectrometría de masas.
- Uso SDS/poliacrilamida gel electroforesis separar una fracción del sobrenadante eluidos de UV y la misma fracción del material dejado en los granos después de elución de la UV.
Nota: El análisis puede incluir también una parte alícuota de los granos de la muestra antes de la elución de la UV. - Manchar el gel que contienen las proteínas separadas mediante un kit de tinción de plata disponible en el mercado.
- Evaluar la eficiencia de UV-elución comparando las intensidades de proteínas presentes en el sobrenadante eluidos de UV y los que quedan en los granos después de la irradiación UV.
- Suprimir las bandas de proteínas de interés y determinar sus identidades por espectrometría de masa usando protocolos estándar10,15.
6. global análisis de muestra eluida de UV por espectrometría de masas.
- Analizar directamente una fracción del sobrenadante UV eluida por espectrometría de masas para determinar el proteoma completo del material purificado de manera imparcial.
Nota: Esto puede hacerse por solución en el tratamiento de las muestras purificadas con tripsina seguida de protocolos estándar de espectrometría de masas para determinar la identidad de la generar péptidos10,15.
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Representative Results
El método de elución de la UV fue probado con dos substratos de RNA síntesis química covalente Unidos en el extremo 5' a la molécula de pcB (configuracióncis ): pcB-SL (figura 1) y RNAs de pcB-dH3/5 m (figura 2). El nucleótido 31 pcB-SL RNA contiene una estructura de lazo del vástago seguida por una cola trenzada solo 5 nucleótidos y su secuencia es idéntica al extremo 3' de la histona maduro ARNm (es decir., después de la división de pre-mRNA de la histona por RNPnp U7). Esta secuencia única es un sitio de Unión conocido para dos proteínas presentan en la fracción citoplasmática mamífera: SLBP y 3' hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m es un fragmento de 63-nucleótido de histona H3 pre-mRNA de Drosophila y además el lazo del vástago contiene una secuencia que une RNPnp U7 de Drosophila (figura 2).
dH3 Ext (125 nucleótidos) es un ejemplo de sustratos más de RNA que pueden ser generados por la transcripción T7 y provisto de biotina y un espaciador foto escindibles en trans por el recocido a pcB, 22mer, un oligonucleótido químicamente sintetizado adaptador ( Trans configuración). pcB/22mer contiene los dos grupos en el extremo 5' y consta de 22 2' O-metil-modifed nucleótidos (Figura 3A). 19 nucleótidos en el extremo 3' de los pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) son complementarios a los nucleótidos último 19 de dH3 Ext pre-mRNA. Este pre-ARNm además de ser más no difiere significativamente de la sintético pcB-dH3 / 5m, que contiene la misma clave dos señales de procesamiento: lazo del vástago y sitio U7-obligatorio.
pcB-SL RNA se incubó con 1 mL de extracto de S100 preparado por ultracentrifugación (100.000 x g durante 1 h) de una fracción citoplasmática obtenida a partir de células de mieloma de ratón19 y el efecto y eficacia de UV-elución primero se analizaron mediante tinción de plata. Se detectaron una serie de proteínas en granos de estreptavidina antes UV-elución (figura 1B, carril 1). Irradiación de onda larga UV publicado sólo algunas de estas proteínas en el sobrenadante (figura 1B, carril 3), dejando un fondo inespecífico en los granos (figura 1B, carril 2), por lo tanto, destacando la importancia de la etapa de elución de la UV. Proteínas UV eluidos fueron identificadas por espectrometría de masas como 3' hExo y SLBP, con SLBP está representada por proteínas completas (FL) y un número de productos de degradación más cortos (DP). Pequeñas cantidades de otras proteínas, identificados como proteínas de unión de varias RNA (restrictivas), fueron liberadas también selectivamente a solución por la irradiación UV (figura 1B, carril 3).
pcB-dH3 / 5m pre-mRNA (figura 2) o Ext dH3 pre-mRNA recocido a pcB/22mer (figura 3) se incubaron con 1 mL de un extracto nuclear de Drosophila Kc células para formar complejos20,21de procesamiento. Para evaluar mejor la especificidad de las proteínas que se unen a cada pre-mRNA de la histona, un control negativo fue preparado en paralelo mediante la adición de extracción de dos competidores a la nuclear: SL RNA que secuestra SLBP y un corto oligonucleótido antisentido que pares con la base el snRNA U7 y previene la interacción de la RNPnp U7 con su sitio en el pre-mRNA.
El paso de rayos UV-elución del pre-mRNA inmovilizado pcB-dH3 / 5m dio lugar a una liberación selectiva de sólo un pequeño número de proteínas en el sobrenadante (figura 2B, carril 1), con una intensa formación de proteínas no específicas en los granos (figura 2B , carril 3). Estas proteínas, marcados A-I, fueron identificados por espectrometría de masas como componentes de la U7 RNPnp15. La muestra también contenida parcialmente degradado SLBP que migra de 10 kDa y sólo puede ser visible en geles de poliacrilamida/SDS una concentración más alta. Estas proteínas no fueron detectadas en presencia de los dos competidores de procesamiento que bloquean la Unión de RNPnp U7 a pre-mRNA de la histona (figura 2B, carril 2).
Los mismos componentes de Drosophila U7 RNPnp fueron liberados a la solución por la irradiación UV de un inmovilizado dúplex compuesto por dH3 Ext pre-mRNA y pcB/22mer (figura 3B, carril 1). Esta muestra además contiene múltiples proteínas RNA que interactuaban con el oligonucleótido pcB/22mer usado en exceso para formar un duplex con dH3 Ext pre-mRNA. En contraste con las subunidades de la U7 RNPnp, estas proteínas contaminantes, así como todas las proteínas de fondo en los granos, persistieron en la presencia de los competidores de procesamiento (figura 3B, comparar carriles 1 y 2 y carriles 3 y 4).
Una pequeña fracción de los complejos de procesamiento contiene UV sobrenadante y la misma fracción del sobrenadante UV de un control negativo (preparado en presencia de los oligonucleótidos dos competidor y por lo tanto, carecer de complejos de procesamiento) pueden ser directamente analizados por espectrometría de masas sin una previa separación de las proteínas eluídas por gel electroforesis15. Este método es muy sensible en la detección de todas las proteínas eluídas independientemente de su tamaño y abundancia y junto con la muestra negativa proporciona una lista completa e imparcial de las proteínas que se asocian específicamente con el pre-mRNA de la histona para llevar a cabo el extremo 3' proceso de reacción.
Figura 1: purificación de proteínas citoplásmicas de ratón destinado a pcB-SL RNA. (A) A diagrama de síntesis química pcB-SL RNA (31-nucleótidos). Biotina (Biot) en el extremo 5' va seguida de un moiety foto escindibles (pc) sensible a los rayos UV de onda larga (366 nm), átomo de dos 18 espaciadores y 31 nucleótidos que forman la estructura conservada de lazo del vástago en el extremo 3' de los mRNAs maduros histona. (B) pcB-SL RNA se incubó con S100 extracto citoplasmático de las células de mieloma de ratón. El RNA y proteínas encuadernadas se purificaron en granos de estreptavidina, extensivamente lavados, UV eluida y analizadas por tinción (carril 3) de plata. Proteínas inmovilización en perlas de estreptavidina antes de elución de la UV y a la izquierda en las cuentas después de elución de la UV se muestran en los carriles 1 y 2, respectivamente. Posición de los marcadores de tamaño de la proteína (kDa) está indicado a la izquierda.
Figura 2: Purificación de complejos de procesamiento de Drosophila montada en pcB-dH3/5 m pre-mRNA. (A) un diagrama de químicamente sintetizado Drosophila-pre-mARN específico pcB-dH3/5 m (63-nucleótidos). Biotina (Biot) en el extremo 5' va seguida de un moiety foto escindibles (pc), dos separadores de átomo de 18 y 63 nucleótidos que contienen el proceso esencial de dos secuencia elementos: estructura de lazo del vástago y sitio U7-obligatorio. Cinco nucleótidos alrededor del sitio de la hendidura mayor situado entre los dos elementos se modifican con un 2' grupo de O-metil bloquear el escote por la RNPnp U7 durante el montaje complejo (cruzado líneas). (B) pcB-dH3/5 m fue incubado con un extracto nuclear de Drosophila para montar complejos de procesamiento. En el control negativo, el extracto nuclear contiene dos competidores de procesamiento para bloquear la Unión de RNPnp SLBP y U7 a pre-mRNA de la histona. Los complejos montados fueron inmovilizados en perlas de estreptavidina, extensivamente lavados y liberados a la solución por la exposición de la muestra a la onda larga UV. Se analizaron las mismas fracciones de las cuentas después de UV-elución (UV-granos) y el material eluyó en UV (UV-Devore) por tinción de plata. Posición de marcadores de tamaño de proteínas (en kDa) y estreptavidina (SA) se indica a la derecha.
Figura 3: Purificación de complejos de procesamiento de Drosophila montado sobre dH3 Ext pre-ARNm unido al grupo foto escindibles en trans. (A) un diagrama de dH3 Ext duplex generado por recocido dH3 generado T7 Ext pre-mRNA y pcB/22mer síntesis química de oligonucleótidos con la siguiente secuencia: 5' Biot/pc/18 años/18 años/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. En los oligonucleótidos, biotina (Biot) se coloca en el extremo 5' y es seguida por el vinculador foto escindibles (pc). Los últimos 19 nucleótidos (subrayados en la secuencia anterior) son complementarios a la extensión de 3' a dH3 Ext pre-mRNA. La presencia de 2' modificaciones de O-metil (no indicados en la figura) tiene dos propósitos: estabiliza el oligonucleótido contra Extracto de nucleasas y aumenta la fuerza de lo dúplex formado con dH3 Ext pre-mRNA. (B) dH3 Ext duplex se incubó con una Drosophila Kc nuclear extrae en ausencia o en presencia de competidores, inmovilizados en cuentas de estreptavidina extensivamente lavados y UV eluyó junto con las proteínas límite de procesamiento. El mismo fracciones de las cuentas después de UV-elución (UV-granos, carriles 3 y 4) y el material eluyó en UV (UV-Devore, carriles 1 y 2) se analizaron mediante tinción de plata. Componenst específica de los complejos de procesamiento (aquellos que son eliminados por competencia de procesamiento) se indica con una letras F. Importante no específicos RNA proteínas (las que son eluidos UV pero persisten en presencia de los dos competidores de procesamiento) se indican con asteriscos. Posición de los marcadores de tamaño de la proteína (kDa) está indicado a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método descrito aquí es sencillo y además incorporando a un enlazador foto escindibles y el paso de rayos UV-elución no difiere de los métodos utilizados que se aprovechan de la fuerte interacción entre biotina y estreptavidina. El paso de rayos UV-elución es muy eficiente, liberando por lo general más del 75% de lo ARN inmovilizado y proteínas de granos de estreptavidina, dejando atrás un alto fondo de proteínas que se unen no específicamente a las cuentas asociadas. Mediante la eliminación de este fondo, el paso de rayos UV-elución rendimientos notablemente puras muestras adecuadas para análisis directo por tinción de plata, espectrometría y análisis funcionales.
Como resultado de la participación de un relativamente pocos y simples pasos, el método de elución UV es altamente reproducible, proporcionar cantidades suficientes de la RNPnp U7 para la tinción de plata de tan poco como 100 μl de ratón y Drosophila nuclear extractos de15. El método es una alternativa atractiva a otros estrategias experimentales anteriormente utilizados para purificar complejos RNA/proteína, incluyendo selección de sustratos de RNA con un sitio de unión de MS2 e inmovilización de complejos asociados en granos de amilosa mediante una fusión de MS2-MBP proteína. La estrategia de MS2, mientras que el éxito en aislar Espliceosomas relativamente abundantes y canónico 3' final procesamiento complejos22,23, se ha podido producir cantidades suficientes de procesar complejos conteniendo RNPnp U7 (ZD, inédito resultados), que es aproximadamente 100 veces menos concentraron en las células animales que los principales U1 spliceosomal RNPnp.
Muchos aspectos del protocolo deben modificarse para satisfacer diversos objetivos de la investigación individual y conseguir resultados óptimos con otros complejos de RNA/proteína. En primer lugar, es importante para que coincida con la cantidad de sustrato de RNA utilizado para el montaje del complejo con la cantidad de este complejo que existe en el extracto. Para limitar complejos, incluyendo U7 RNPnp, usando demasiado sustrato es contraproducente, sólo aumentando el fondo de la inespecífica RNA-proteínas en el sobrenadante de la UV. En segundo lugar, también es importante optimizar la longitud y la temperatura de incubación para promover el vigoroso montaje del complejo, evitando al mismo tiempo su disociación debido a la proteólisis potencial o excesiva degradación del RNA.
Una clave difícil en el trabajo con el dependiente de la U7 procesamiento complejos y complejos de RNA/proteína similares que llevan actividades enzimáticas es que después de ser armada pueden disociar como resultado de la catálisis. Escote de histona pre-mRNAs ocurre rápidamente incluso a bajas temperaturas, reduciendo significativamente el rendimiento de los complejos de procesamiento purificada. Para evitar este efecto indeseable, se modificaron el sitio de importante escote y cuatro nucleótidos cercanos en pcB-dH3 / 5m pre-mRNA durante la síntesis química con 2' O-metílico grupos (5m)10. Este pre-mRNA es casi totalmente resistente a la hendidura por RNPnp U7 y puede ser incubada con un extracto nuclear a temperatura ambiente durante 60 min. sin causar interrupción compleja detectable. El T7 generado dH3 que ext recocido a pcB/22mer carece de estas modificaciones y su incubación con un extracto de la nuclear se lleva a cabo en hielo durante 5 minutos o menos para limitar la catálisis. pcB-SL RNA contiene maduro 3' extremo de la histona mRNA y en extractos citoplásmicos no sufre ningún proceso de adición. 3' hExo, que es dependiente del magnesio 3' - 5' exonucleasa es capaz de eliminar nucleótidos de 2-3 de la cola trenzada solo en vivode24,25 pero en vitro que su actividad es inhibida por la presencia de EDTA16. Como resultado, pcB-SL RNA puede ser incubada en extractos citoplásmicos a temperatura ambiente durante un tiempo prolongado sin efectos adversos, aunque por lo general una corta incubación en hielo es suficiente para formar un complejo ternario del ARN con hExo SLBP y 3'.
De las dos variantes alternativas del método de elución de la UV, utilizando sustratos de RNA con biotina y el vinculador foto escindibles en cis (covalentemente atado extremo 5' del ARN) en general es más simple y da muestras relativamente puras. Una importante limitación de este enfoque es que los dos grupos pueden acoplarse covalentemente a sustratos de RNA no exceda ~ 65 nucleótidos. Más objetivos vinculantes de RNA pueden fijarse a la molécula de pcB en trans a través de un oligonucleótido de adaptador. Sin embargo, este enfoque puede producir mayor fondo de proteínas no específicas que tienden a enlazar exceso de los oligonucleótidos de adaptador. Por lo tanto es importante utilizar sólo un mínimo exceso molar de los oligonucleótidos suficiente para enlazar todo el substrato pre-mRNA utilizado en el experimento.
La naturaleza de la secuencia, longitud y química de oligonucleótidos adaptador puede variar para mejorar su capacidad de base par con las secuencias complementarias en los sustratos de RNA, reduciendo su capacidad de interactuar con proteínas no específicas RNA. Finalmente, más sustratos pre-mRNA duplicados con oligonucleótidos adaptador pueden ser inmovilizados en los granos antes de ser utilizado para la formación del complejo estreptavidina. Una ventaja de este enfoque de preselección es que elimina de las moléculas de ARN de la muestra que se ha podido templar a los oligonucleótidos. Estas moléculas conservan una capacidad normal para montar en un complejo en el extracto, pero son incapaces de enlazar cuentas de estreptavidina, reduciendo parcialmente el rendimiento de la purificación.
Además de purificación complejos montados sobre sustratos de RNA monocatenario, el método de elución de la UV de manera similar se puede utilizar para purificar proteínas o complejos proteicos que se unen a secuencias de ADN de hebra simple y doble.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Agradecemos a nuestros colegas y colaboradores por su contribución a nuestro trabajo. Este estudio fue apoyado por los NIH otorgan GM 29832.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
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