Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltsteg rensing av Macromolecular komplekser ved hjelp av RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker

Published: January 3, 2019 doi: 10.3791/58697
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

RNA/protein komplekser renset med botin-streptavidin strategi er elut til løsningen under denaturing forhold i et skjema som er uegnet for ytterligere rensing og funksjonell analyse. Her beskriver vi en endring av denne strategien som benytter et foto-cleavable linker i RNA og en mild UV-elueringsrør trinn, gir native og funksjonell RNA/protein komplekser.

Abstract

I mange år, blitt det eksepsjonelt sterke og raskt dannet samspillet mellom biotin og streptavidin ble benyttet for delvis rensing av biologisk viktig RNA/protein komplekser. Men denne strategien lider en stor ulempe som begrenser dens bredere utnyttelse: biotin/streptavidin samspillet kan brytes under denaturing som også forstyrre integriteten til eluted komplekser, dermed utelukker deres påfølgende funksjonell analyse og/eller ytterligere rensing med andre metoder. I tillegg er eluted prøvene ofte forurenset med bakgrunn proteiner som nonspecifically knytter streptavidin perler, kompliserer analyse av renset komplekser av sølv flekker og massespektrometri. For å overvinne disse begrensningene, vi utviklet en variant av biotin/streptavidin strategi som biotin er knyttet til en RNA substrat via et foto-cleavable linker og komplekser immobilisert på streptavidin perler er selektivt elut til løsningen i en opprinnelige form av langbølget UV, forlater bakgrunn proteiner på perlene. Kortere RNA bindende underlag kan syntetiseres kjemisk biotin og foto-cleavable linker covalently festet til 5 av de mens lengre RNA underlag kan leveres med de to gruppene av et utfyllende oligonucleotide. Disse to varianter av metoden UV-elueringsrør testet for rensing av U7 snRNP avhengig av behandling komplekser som cleave histone pre-mRNAs på 3 slutten og begge viste sammenligne gunstig til andre tidligere utviklet metoder for rensing. UV-elut prøvene inneholdt lett synlig mengder U7-snRNP som var uten større protein forurensninger og egnet for direkte analyse av massespektrometri og funksjonelle analyser. Metoden beskrevet kan lett tilpasses for rensing av andre RNA bindende komplekser og brukes sammen med single - og double-strandet DNA bindende for å rense DNA-spesifikke proteiner og macromolecular komplekser.

Introduction

I eukaryoter gjennomgå RNA polymerase II-generert mRNA prekursorer (pre-mRNAs) flere modning hendelser i kjernen før de blir fullt funksjonell mRNA maler for proteinsyntese i cytoplasma. En av disse hendelsene er 3 slutten behandling. For de aller fleste av pre-mRNAs innebærer 3 slutten behandling cleavage koblet til polyadenylation. Denne totrinns reaksjon er katalysert av et relativt rikelig kompleks som består av mer enn 15 proteiner1. Dyr replikering-avhengige histone pre-mRNAs behandles på 3 slutten av en annen mekanisme der den sentrale rollen spilles av U7 snRNP, en lav overflod består av U7 snRNA ~ 60 nukleotider og flere proteiner2,3 . U7 snRNA base parene med en bestemt sekvens i histone pre-mRNA og en av underenheter av U7-snRNP gir cleavage reaksjonen, genererer eldre histone mRNA uten en poly(A) hale. 3 slutten behandling av histone pre-mRNA krever også stilk-Loop bindende Protein (SLBP), som binder en bevart stilk-loop ligger over webområdet cleavage og forbedrer rekruttering av U7-snRNP til underlaget2,3. Studier identifisere individuelle komponenter av U7-snRNP har vært utfordrende på grunn av lav konsentrasjon av U7-snRNP i dyreceller og tendensen til komplisert å distansere eller gjennomgå delvis proteolyse under renselsen ved å bruke milde vaskemidler4,5,6, høy salt vasker og/eller flere brukt kromatografiske trinn7,8,9.

Nylig for å bestemme sammensetningen av U7-avhengige produksjonsutstyr, et kort fragment av histone pre-mRNA inneholder biotin 3 eller 5' ble inkubert med en kjernefysisk ekstrakt og sammensatte komplekser ble tatt på streptavidin-belagt agarose perler5,6,10. Eksepsjonelt sterke samhandling mellom biotin og streptavidin, var proteiner immobilisert på streptavidin perler elut under denaturing forhold ved koking i SDS og analyseres av sølv flekker og massespektrometri. Mens denne enkle tilnærming identifisert en rekke komponenter av U7-snRNP, ga det relativt grov prøver, ofte forurenset med et stort antall bakgrunn proteiner nonspecifically bundet til streptavidin perler, potensielt maskering noen av komponentene produksjonsutstyr og hindre gjenkjenningen på sølv farget gels5,6,10. Viktigere, utelukket denne tilnærmingen også alle funksjonelle studier med isolert materialet og rensing sin videre til homogenitet av flere metoder.

En rekke endringer ble foreslått over tid å ta nesten uhelbredelig natur biotin/streptavidin samhandling, med de fleste av dem blir utformet å enten svekke samspillet eller gi en kjemisk cleavable spacer arm i den biotin inneholder reagenser11,12. Ulempen med alle disse endringene var at reduserer effektiviteten av metoden eller ofte krever ikke-fysiologiske forhold under elueringsrør trinnet, jeopardizing enten integritet eller aktivitet av renset proteiner.

Her beskriver vi en annen tilnærming for å løse iboende problemet av biotin/streptavidin strategi ved hjelp av RNA underlag som biotin er covalently knyttet til 5' ende via en foto-cleavable 1-(2-nitrophenyl) ethyl moiety som er følsom for lenge bølge UV13,14. Vi testet denne tilnærmingen for rensing av begrensende U7-avhengige behandling maskiner fra Drosophila og pattedyr kjernefysiske ekstrakter15. Etter en kort inkubering av histone pre-mRNA inneholder biotin og foto-cleavable linker med en kjernefysisk ekstrakt, samlet behandling komplekser er immobilisert på streptavidin perler, grundig vasket og forsiktig ut til løsningen i opprinnelig form av 360 nm UV lyseksponering. UV-elueringsrør metoden er svært effektiv, rask og enkel, gir tilstrekkelig mengder U7-snRNP å visualisere komponentene av sliver flekker fra så lite som 100 µL av ekstrakt15. UV-elut materialet er gratis bakgrunn proteiner og egnet for direkte massespektrometri analyse, flere rensing trinnene og enzymatiske analyser. Samme metode kan vedtas for rensing av andre RNA/protein komplekser som krever relativt kort RNA bindende områder. Biotin og foto-cleavable linker kan også covalently knyttes til single - og double-strandet DNA, kan utvide UV-elueringsrør metoden for rensing av ulike DNA/protein komplekser.

Syntese av RNA underlag som inneholder covalently vedlagt biotin og foto-cleavable linker er praktisk bare med sekvensene som ikke overstiger ~ 65 nukleotider, bli dyrt og ineffektivt for betydelig lengre sekvenser. For å løse dette problemet, utviklet vi også en alternativ tilnærming som passer for mye lengre RNA forpliktende mål. I denne tilnærmingen, RNA av alle lengden og nukleotid er generert i vitro med T7 eller SP6 transkripsjon og herdet til en kort utfyllende oligonucleotide som inneholder biotin og foto-cleavable linker nederst 5' (trans konfigurasjon). Resulterende duplex blir brukt å rense personlige bindende proteiner eller macromolecular komplekser på streptavidin perler følger samme protokollen på RNA substrater som inneholder bilde-cleavable biotin knyttet covalently (cis konfigurasjon). Med denne endringen, kan Foto-cleavable biotin brukes sammen med i vitro generert utskrifter som inneholder hundrevis av nukleotider, utvide UV-elueringsrør metoden for rensing av et bredt utvalg av RNA/protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. substratet

Merk: RNA underlag kortere enn ~ 65 nukleotider kan syntetiseres kjemisk biotin (B) og foto-cleavable (pc) linker (sammen omtales som Foto-cleavable biotin eller pcB) covalently festet til RNA 5' (cis konfigurasjon). RNA underlag som inneholder betydelig lengre bindende områder må være generert i vitro med T7 (eller SP6) transkripsjon og senere herdet til en kort komplementære adapter oligonucleotide som inneholder pcB moiety på 5' slutten (trans konfigurasjon) (figur 1).

  1. Bindende områder bestående av færre enn ~ 65 nukleotider, bruke kommersielle produsent (Tabell for materiale) for å syntetisere kjemisk RNA rundt med pcB covalently festet til RNA 5' (figur 1A og figur 2A). Oppløse i sterilt vann oppnå ønsket konsentrasjon og lagre i små dele på-80 ° C.
  2. Bindende betydelig generert lenger enn ~ 65 nukleotider, skjemaet en delvis duplex av en i vitro RNA av interesse og en utfyllende adapter oligonucleotide som inneholder pcB moiety på 5' slutten (figur 3A).
    1. Utføre T7 transkripsjon på enten en linearisert plasmider DNA eller en passende PCR-mal for å generere RNA med binding området rundt utvidet på 3 slutten av en ~ 20-nukleotid tilfeldig rekkefølge.
    2. Bruk en kommersiell produsent (Table of Materials) til kjemisk syntetisere en adapter oligonucleotide som er komplementære til 3 utvidelsen i T7-generert RNA og pcB på 5' slutten (figur 3A).
      Merk: To 18-atom spacere og 2-3 ikke-utfyllende nukleotider kan plasseres på 5' slutten av oligonucleotide å redusere potensielle steric hindring mellom bundet kompleks og streptavidin perler. Også er det ønskelig at oligonucleotide endres jevnt med en 2-' O-methyl gruppe å øke styrken på duplex og gi motstand mot ulike nucleases.
    3. Anneal T7-generert RNA til pcB adapter oligonucleotide.
      1. Mix 20 pmol av den og 100 pmol av adapter pcB oligonucleotide (1:5 molar ratio) i en 1,5 mL tube inneholder 100 µL av bindende buffer med følgende sammensetning: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, 15% glyserol, 10 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA).
        Merk: Det er viktig å bruke en minimal mengde adapter oligonucleotide som er tilstrekkelig til å danne en med de fleste (hvis ikke alle) pre-mRNA substrat brukes i annealing reaksjonen. Dette kunne beleilig bestemmes ved merking RNA substrat på 5' slutten med 32P, annealing merket underlaget med økende mengder adapter oligonucleotide bruker ulike buffer forhold og overvåking oppbevaring av den radioaktivt signal på streptavidin perler etter flere vasker av perler med bindende bufferen.
      2. Sett røret i kokende vann i 5 min.
      3. La vannet avkjøles til romtemperatur.

2. komplekse samlingen

  1. Supplement 1 mL av en mus kjernefysiske pakke (eller en annen pakke valg) med 80 mM EDTA pH 8 til en siste konsentrasjon av 10 mM blokkere uspesifikke metall-avhengige nucleases som finnes i ekstraktet.
    Merk: Dette vil resultere i justere buffer i pakke til samme sammensetning som i bindingen bufferen (se trinn 1.2.3.1). EDTA påvirker ikke i vitro behandling av histone pre-mRNAs, men kan være skadelig ved rensing proteiner eller protein komplekser som monterer på en magnesium-avhengig måte. I slike tilfeller, bør EDTA unngås.
  2. Legge 5-10 pmol av RNA underlaget merket med pcB moiety i cis (se trinn 1.1) eller trans (se trinn 1.2.3.3) til 1 mL av ekstraktet inneholder 10 mM EDTA.
    Merk: Mengden av RNA må vurderes nøye i en rekke prøve eksperimenter. Bruker for mye RNA substrat for rensing av en begrensende kompleks kanskje mot sin hensikt, betydelig økt bakgrunnen uspesifikke RNA bindende proteiner uten noen effekt på avkastningen av spesifikke proteiner.
  3. Inkuber RNA underlaget med ekstrakt i 5 min på isen, noen ganger blander prøven.
    Merk: Både tid og temperatur på inkubering må etableres empirisk og kan variere betydelig, avhengig av spesifikke typen RNA/protein komplekset.
  4. Spinne inkubasjon blandingen i en pre-avkjølt microcentrifuge i 10 min 10 000 x g å fjerne alle potensielle precipitates og nøye samle den supernatant unngå overføring av pellets.

3. immobilisering av RNA/protein komplekser på Streptavidin perler.

  1. Overføre ~ 100 µL av streptavidin agarose perle suspensjon fra en kommersiell leverandør (Table of Materials) til en 1,5 mL tube og øke volumet med bindende bufferen (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, 15% glyserol, 10 mM EDTA).
    Merk: Denne bufferen skal ha samme sammensetning som annealing blandingen og ekstrakt brukes for komplekse samlingen (trinn 2.1).
  2. Samle perler nederst på røret ved spinning i 2-3 min 25 x g og Sug opp nedbryting.
  3. Gjenta samme vask/spinning 2 - 3 ganger å equilibrate perler med bindende bufferen.
    Merk: På slutten av dette trinnet, pellet av perler bør har ~ 30 µL.
  4. Last nedbryting inneholder sammensatte komplekset (trinn 2,4) over equilibrated streptavidin agarose perler.
  5. Rotere 1 h på 4 ° C til nakkens RNA og bundet komplekser på perlene.
  6. Samle perler nederst på røret ved spinning i 2-3 min 25 x g.
    Merk: Bruk en sving ut rotoren for å unngå betydelige tap av perlene hvis de har en tendens til å følge siden av røret i kantete rotorer.
  7. Sug opp nedbryting og skyll perlene to ganger med 1 mL av bindende buffer, bruker de samme sentrifugering betingelsene.
  8. Legg 1 mL av bindende bufferen og rotere prøven 1t på 4 ° C.
    Merk: Dette trinnet kan forkortes hvis komplekset dannet på underlaget tendens til å distansere.
  9. Nedspinning perlene i 2-3 min 25 x g, Legg 1 mL av bufferen og overføre suspensjon til en ny tube.
  10. Rotere for en ekstra 1 h eller kortere hvis komplekset ikke er stabil, spinne ned i 2-3 min 25 x g og overføre perler til et 500 µL rør i 200 µL bindende bufferen.

4. UV-elueringsrør.

  1. Slå på en høy intensitet UV-lampen emitting 365 nm UV lys i 5-10 min før full lysstyrke.
    Merk: Dette er avgjørende for å oppnå maksimal energi av UV utslipp ved starten av bestråling.
  2. Fylle opp nederst en Petriskål (100 mm x 15 mm) med tett pakket is og stakk det over i dish lokket.
  3. Kort vortex tube som inneholder immobilisert komplekset, plasser den horisontalt på isen og dekk med forvarmes lampen, at prøven er innen avstand av 2-3 cm på overflaten av pære.
    Merk: Hvis avstanden er for stor, bruke flere Petri retter eller annet passende for å bringe prøven nærmere til pære.
  4. Irradiate totalt 30 min, snu ofte og vortexing røret å sikre ensartet eksponering for suspensjon UV og for å hindre overoppheting.
    Merk: For å gi ekstra kjøling, UV-elueringsrør trinnet kan utføres i et kaldt rom. Bytt til en Petriskål med fersk is ved overdreven isen smelter.
  5. Nedspinning perlene i 2-3 min 25 x g og samle nedbryting.
  6. Re-spinn nedbryting bruker de samme betingelsene og samle nedbryting.
    Merk: La en liten mengde nedbryting nederst for å unngå å overføre gjenværende perler.

5. eksempel analyse av sølv flekker etterfulgt av massespektrometri.

  1. Bruk SDS/polyakrylamid gel geleelektroforese å skille en brøkdel av UV-elut nedbryting og samme brøkdel av materialet igjen på perlene etter UV elueringsrør.
    Merk: Analyse kan også inneholde en aliquot av perlene trukket fra prøven før UV-elueringsrør.
  2. Stain gel inneholder atskilt proteiner ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig sølv flekker kit.
  3. Evaluere effektiviteten av UV-elueringsrør ved å sammenligne intensiteten av proteiner i nedbryting UV-elut og de igjen på perlene etter UV-bestråling.
  4. Avgiftsdirektoratet protein band rundt og finne identitetene ved massespektrometri bruker standard protokoller10,15.

6. global analyse av UV-elut prøven ved massespektrometri.

  1. Direkte analysere en brøkdel av UV-elut nedbryting av massespektrometri å avgjøre det hele proteom renset materialet på en saklig måte.
    Merk: Dette kan gjøres ved-løsning behandling av renset prøvene med trypsin etterfulgt av standard massespektrometri protokoller for å fastslå identiteten Generer peptider10,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UV-elueringsrør metoden ble testet med to kjemisk syntetisert RNA underlag covalently festet på 5' slutten til pcB moiety (cis konfigurasjon): pcB-SL (figur 1) og pcB-dH3/5 m RNAs (figur 2). Den 31-nukleotid pcB-SL RNA inneholder en stilk-loop struktur etterfulgt av en 5-nukleotid enkelt strandet hale og sekvensen er identisk med 3 slutten av modne histone mRNA (dvs., etter i spalting av histone pre-mRNA av U7 snRNP). Denne unike sekvensen er en kjent bindende nettsted for to proteiner tilstede i pattedyr cytoplasmatiske brøken: SLBP og 3 hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m er en 63-nukleotid fragment av Drosophila H3 histone pre-mRNA og i tillegg til stilk-løkken inneholder en sekvens som binder Drosophila U7 snRNP (figur 2).

dH3 Ext (125 nukleotider) er et eksempel på lengre RNA underlag som kan genereres av T7 transkripsjon og som biotin og en foto-cleavable spacer i trans annealing til pcB/22mer, en kjemisk syntetisert adapter oligonucleotide ( trans konfigurasjon). pcB/22mer inneholder de to gruppene etter 5' og består av 22 2 O-metyl-modifed nukleotider (figur 3A). 19 nukleotider etter 3 pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) er komplementære til de siste 19 nukleotider i dH3 Ext pre-mRNA. Denne pre-mRNA foruten å være lengre ikke avvike betydelig fra syntetiske pcB-dH3 / 5m, som inneholder de samme to viktige behandling signaler: stem-loop og U7-binding området.

pcB-SL RNA ble inkubert med 1 mL av S100 ekstrakt utarbeidet av ultracentrifugation (100.000 x g 1t) av en cytoplasmatiske brøkdel musen myelom celler19 og effekten og effektiviteten av UV-elueringsrør ble først analysert av sølv flekker. En rekke proteiner ble funnet på streptavidin perler før UV-elueringsrør (figur 1B, lane 1). Bestråling med langbølget UV utgitt bare noen av disse proteinene til nedbryting (figur 1B, lane 3), og en uspesifisert bakgrunn på perler (figur 1B, lane 2), derav understreker viktigheten av UV-elueringsrør trinnet. Store UV-elut proteiner ble identifisert av massespektrometri 3 hExo og SLBP, med SLBP blir representert av full lengde protein (FL) og en rekke kortere nedbrytningsprodukter (DP). Mindre mengder av andre proteiner, identifisert som ulike RNA bindende proteiner (RBPs), ble også selektivt utgitt til løsning av UV bestråling (figur 1B, lane 3).

pcB-dH3 / 5m pre-mRNA (figur 2) eller dH3 Ext pre-mRNA herdet til pcB/22mer (Figur 3) ble inkubert med 1 mL av en kjernefysisk utdrag fra Drosophila Kc cellene til skjemabehandling komplekser20,21. Å bedre vurdere spesifisiteten av proteiner som binder seg til hver histone pre-mRNA, en negativ kontroll ble utarbeidet i parallell ved å legge til to konkurrenter til kjernefysiske ekstra: SL RNA som sequesters SLBP, og en kort antisense oligonucleotide som base parene med U7 snRNA og hindrer samspillet av U7-snRNP med sitt nettsted på pre-mRNA.

UV-elueringsrør trinn i immobilisert pcB-dH3 / 5m pre-mRNA resulterte i en selektiv utgivelsen av bare et lite antall proteiner til nedbryting (figur 2B, lane 1), med en intens bakgrunn av ikke-spesifikke proteiner på perler (figur 2B , lane 3). Disse proteiner, merket med A-jeg ble identifisert av massespektrometri som komponenter av U7 snRNP15. Utvalget inneholdt også delvis degradert SLBP som overfører på 10 kDa og kan bare være synlig på høyere konsentrasjon SDS/polyakrylamid gels. Alle disse proteinene ble ikke funnet i nærvær av to behandling konkurrentene som blokkerer binding av U7 snRNP til histone pre-mRNA (figur 2B, lane 2).

De samme komponentene i Drosophila U7 snRNP ble gitt til løsning av UV bestråling av en immobilisert dupleks dH3 Ext pre-mRNA og pcB/22mer (figur 3B, lane 1). Dette eksemplet inneholder i tillegg flere RNA bindende proteiner som interaksjon med pcB/22mer oligonucleotide brukes i overkant for å danne en tosidig med dH3 Ext pre-mRNA. I motsetning til underenheter av U7 snRNP, disse skadelige proteiner, samt alle bakgrunn proteiner som forble på perlene, faste i nærvær av behandling konkurrentene (figur 3B, sammenligne baner 1 og 2 og baner 3 og 4).

En liten brøkdel av UV-nedbryting inneholder behandling komplekser og samme brøkdel av UV-nedbryting fra en negativ kontroll (forberedt i nærvær av to konkurrent oligonucleotides og dermed mangler behandling komplekser) kan være direkte analyseres av massespektrometri uten en forutgående separasjon av eluted proteiner av gel geleelektroforese15. Denne metoden er svært følsom oppdage alle eluted proteiner uavhengig av deres størrelse og overflod og sammen med negative prøven gir en fullstendig og upartiske liste av proteiner som spesielt knytter histone pre-mRNA å gjennomføre 3 slutten behandler reaksjon.

Figure 1
Figur 1: rensing av musen cytoplasmatiske proteiner bundet til pcB-SL RNA. (A) A diagram av kjemisk syntetisert pcB-SL RNA (31-nukleotider). Biotin (Biot) på 5' slutten etterfølges av en foto-cleavable moiety (pc) følsomme for lenge bølge UV (366 nm), to 18 atom spacere og 31 nukleotider som bevarte stilk-loop strukturen på 3 slutten av modne histone mRNAs. (B) pcB-SL RNA ble inkubert med S100 cytoplasmatiske ekstrakt fra musen myelom celler. RNA og bundet proteiner ble renset på streptavidin perler, grundig vasket, UV elut og analyseres av sølv flekker (lane 3). Proteiner immobilisert på streptavidin perler før UV elueringsrør og igjen på perlene etter UV elueringsrør vises i baner 1 og 2, henholdsvis. Plassering av protein størrelse markører (i kDa) er angitt til venstre.

Figure 2
Figur 2: Rensing av Drosophila behandling komplekser samlet på pcB-dH3/5 m pre-mRNA. (A) et diagram av kjemisk syntetisert Drosophila-spesifikke pcB-dH3/5 m pre-mRNA (63-nukleotider). Biotin (Biot) på 5' slutten etterfølges av en foto-cleavable moiety (pc), to 18-atom spacere og 63 nukleotider som inneholder to rekkefølgen elementer nødvendig behandling: stem-loop struktur og U7-binding området. Fem nukleotider rundt store cleavage området mellom de to elementene endres med en 2' O-methyl gruppe å blokkere spalting av U7-snRNP under komplekse samlingen (krysset linjer). (B) pcB-dH3/5 m ble inkubert med en Drosophila kjernefysiske ekstrakt å montere behandling komplekser. I kontrollen negative inneholder kjernefysiske ekstrakt to behandling konkurrenter å blokkere binding av SLBP og U7 snRNP til histone pre-mRNA. Samlet komplekser var immobilisert på streptavidin perler, grundig vasket og utgitt til løsning av eksponering for eksempel langbølget UV. Samme fraksjoner av UV-elut materialet (UV-sups) og perler etter UV-elueringsrør (UV-perler) ble analysert av sølv flekker. Plasseringen av protein størrelse markører (i kDa) og streptavidin (SA) er angitt til høyre.

Figure 3
Figur 3: Rensing av Drosophila behandling komplekser samlet på dH3 Ext pre-mRNA knyttet til Foto-cleavable gruppen i trans. (A) A diagram av dH3 Ext duplex generert av avspenning T7 generert dH3 Ext pre-mRNA og kjemisk syntetisert pcB/22mer oligonucleotide med følgende sekvens: 5' Biot/pc/18S/18S/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. I oligonucleotide, biotin (Biot) plasseres på 5' slutten og etterfølges av foto-cleavable (pc) linker. De siste 19 nukleotider (understreket i rekkefølgen ovenfor) er komplementære til 3 utvidelsen til dH3 Ext pre-mRNA. Tilstedeværelsen av 2' O-metyl endringer (ikke angitt i figuren) tjener to formål: det stabiliserer oligonucleotide mot ekstra nucleases og øker styrken på duplex med dH3 Ext pre-mRNA. (B) dH3 Ext dobbeltsidig ble inkubert med en Drosophila Kc kjernefysiske ekstra i fravær eller i nærvær av behandling konkurrenter, immobilisert på streptavidin perler, grundig vasket og UV-elut sammen med bundet proteiner. Samme fraksjoner av UV-elut materialet (UV-sups, baner 1 og 2) og perler etter UV-elueringsrør (UV-perler, baner 3 og 4) ble analysert av sølv flekker. Bestemte componenst av behandling komplekser (de som er eliminert av konkurrenter) angis med A til F bokstaver. Store uspesifisert RNA bindende proteiner (de som UV-elut men vedvarer i nærvær av to behandling konkurrentene) identifiseres med stjerner. Plassering av protein størrelse markører (i kDa) er angitt til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden beskrevet her er enkel og dessuten omfatter et foto-cleavable linker og UV-elueringsrør trinnet avvike ikke fra de vanligste bruke metodene som utnytter den ekstremt sterke vekselvirkningen mellom biotin og streptavidin. UV-elueringsrør trinnet er veldig effektivt, vanligvis ut mer enn 75% av de immobilisert og tilhørende proteiner fra streptavidin perler, etterlot seg en høy bakgrunn av proteiner som nonspecifically binder til perler. Ved å eliminere denne bakgrunnen, gir UV-elueringsrør trinnet bemerkelsesverdig ren prøver egnet for direkte analyse av sølv flekker, massespektrometri og funksjonelle analyser.

Som følge av involverer en relativt få og enkle trinn, UV-elueringsrør metoden er svært reproduserbare, gir tilstrekkelig mengder U7-snRNP for sølv flekker fra så lite som 100 µL av musen og Drosophila kjernefysiske ekstrakter15. Metoden er et attraktivt alternativ til andre eksperimentelle strategier tidligere rense RNA/protein komplekser, inkludert merking RNA underlag med en MS2 binding området og immobilizing tilknyttede komplekser på amylose perler via en MS2-MBP fusjon protein. Den MS2 strategien, mens vellykket i isolere relativt rikelig spliceosomes og Kanonisk 3' slutten behandling komplekser22,23, ikke gitt tilstrekkelig mengder behandling komplekser som inneholder U7 snRNP (ZD, upubliserte resultater), som er omtrent 100 ganger mindre konsentrert i dyreceller enn den store U1 spliceosomal snRNP.

Mange aspekter av protokollen må endres å møte ulike personlige forskning mål og gi det beste resultatet med andre RNA/protein komplekser. Først er det viktig å matche beløpet av RNA underlaget brukes for komplekse samlingen med hvor mye Dette komplekset i ekstraktet. For å begrense komplekser, inkludert U7 snRNP, er bruke for mye underlaget mot sin hensikt, bare øke bakgrunnen uspesifisert RNA-bindende proteiner i UV-nedbryting. Andre, er det også viktig å optimalisere lengden og temperaturen i inkubasjon å fremme livskraftige montering av komplekset, hindre samtidig sin avstandtagen på grunn av potensielle proteolyse eller overdreven RNA degradering.

En nøkkel så lett i arbeidet med U7-avhengige behandling komplekser og lignende RNA/protein komplekser som bærer enzymatisk aktiviteter er at etter blir ferdig montert de kan distansere som følge av katalyse. Spalting av histone pre-mRNAs skjer raskt ved lave temperaturer, redusere avkastningen av renset behandling komplekser. For å forhindre denne uønsket effekt, ble store cleavage området og fire nærliggende nukleotider i pcB-dH3 / 5m pre-mRNA endret under syntese med 2' O-metyl grupper (5m)10. Denne pre-mRNA er nesten helt motstandsdyktig mot spalting av U7 snRNP og kan være inkubert med en kjernefysisk ekstrakt ved romtemperatur for 60 min uten å forårsake synlig komplekse avbrudd. T7-generert dH3 Ext herdet til pcB/22mer mangler disse endringene og dens inkubasjon med en kjernefysisk ekstrakt utføres på isen i 5 minutter eller kortere begrense katalyse. pcB-SL RNA inneholder eldre 3' slutten av histone mRNA og i cytoplasmatiske ekstrakter gjennomgår noen tillegg behandling. 3 hExo, som er magnesium-avhengig 3 - 5' exonuclease er i stand til fjerne 2-3 nukleotider av enkelt strandet halen i vivo24,25 men i vitro sin aktivitet er hemmet av tilstedeværelsen av EDTA16. Som et resultat, kan pcB-SL RNA være ruges i cytoplasmatiske ekstrakter i romtemperatur i lengre tid uten bivirkninger, selv om en kort inkubasjon på isen er vanligvis tilstrekkelig til å danne en trefoldig kompleks av RNA med SLBP og 3 hExo.

De to alternative varianter av UV-elueringsrør metoden ved hjelp av RNA underlag med biotin og foto-cleavable linker i cis (covalently knyttet til 5' slutten av RNA) er generelt enklere og gir ren prøver. En viktig begrensning av denne tilnærmingen er at de to gruppene kan covalently knyttet til RNA underlag ikke overstiger ~ 65 nukleotider. Lengre RNA forpliktende mål kan knyttes til pcB moiety i trans via en adapter oligonucleotide. Men kan denne tilnærmingen produsere høyere bakgrunn av ikke-spesifikke proteiner som pleier å binde overkant av adapter oligonucleotide. Det er derfor viktig å bruke bare en minimal molar overskudd av oligonucleotide tilstrekkelig til å binde alle pre-mRNA underlaget i eksperimentet.

Sekvens, lengde og kjemisk natur adapter oligonucleotides kan endres for å forbedre deres evne til å basere par med komplementære sekvenser i RNA substrater, og reduserer deres evne til å samhandle med uspesifisert RNA bindende proteiner. Til slutt, lengre pre-mRNA underlag skal bindes inn med adapter oligonucleotides kan bli immobilisert på streptavidin perler før den brukes for komplekse formasjonen. En fordel med denne pre-utvalget er at det fjerner fra prøven RNA molekyler som kunne anneal til oligonucleotide. Disse molekylene beholder en normal evne å samle til en kompleks i utdrag, men ikke binde streptavidin perler, delvis redusere avkastningen av rensing.

I tillegg til rensende komplekser montert på enkelt-strandet RNA underlag, kan UV-elueringsrør metoden på en lignende måte brukes til å rense proteiner eller protein komplekser som binder single - og double-strandet DNA-sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre

Acknowledgments

Vi takker våre kolleger og samarbeidspartnere for deres bidrag til vårt arbeid. Denne studien ble støttet av NIH gi GM 29832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin-Agarose Sigma S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp Cole-Parmer UX-97600-00
Replacement bulb Cole-Parmer UX-97600-19 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) Promega P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) Promega P1280
Pierce Silver Stain Kit ThermoFisher Scientific 24612

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
  3. Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
  4. Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
  5. Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
  6. Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
  7. Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
  8. Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
  9. Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
  10. Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
  11. Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
  12. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  13. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
  14. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
  15. Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
  16. Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
  17. Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
  18. Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
  19. Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
  20. Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
  21. Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
  22. Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
  23. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
  24. Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
  25. Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).

Tags

Biokjemi problemet 143 affinitet rensing RNA/protein komplekser biotin streptavidin foto-cleavable linker UV-eluering vil U7 snRNP 3 slutt behandling
Enkeltsteg rensing av Macromolecular komplekser ved hjelp av RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski,… More

Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski, Z. Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker. J. Vis. Exp. (143), e58697, doi:10.3791/58697 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter