ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化
Summary
Botin ストレプトアビジン戦略を使用して精製した RNA ・ タンパク質複合体は、更なる精製および機能解析の不適切なフォームで変性条件下に溶出されます。ここでは、ネイティブと完全に機能 RNA ・ タンパク質複合体をもたらす RNA と穏やかな UV-溶出のステップの写真分解リンカーを利用してこの戦略の変更について述べる。
Abstract
長年、ビオチンとストレプトアビジンの非常に強力な急速に形成された相互作用を生物学的に重要な RNA ・ タンパク質複合体の部分的な浄化のため正常に利用されています。しかし、この戦略に苦しんでのより広範な利用を制限する 1 つの主要な欠点: ビオチン/ストレプトアビジン相互作用はまた排除したがって溶出の複合体の整合性を混乱させる条件の変化の下でだけ分けることができます、その後の機能的分析および/または他の方法でさらに精製。さらに、溶出サンプルは頻繁にストレプトアビジン ビーズ、銀染色及び質量分析法によって精製した複合体の解析を複雑に関連付ける特異的背景蛋白質と汚染されています。これらの制限を克服するために開発したビオチンは写真分解リンカーにより RNA 基板に接続されているし、ストレプトアビジン ビーズに固定化した複合体のソリューションに選択的に溶出されますビオチン/ストレプトアビジン戦略のバリアント、長波長紫外線、ビーズの背景蛋白質を残してネイティブ フォーム。一方、2 つのグループに相補的なオリゴヌクレオチドが長い RNA 基板を提供することができますは、短い RNA 結合基板をビオチンと、RNA の 5′ 末端に接続した写真分解リンカー化学的に合成できます。UV 溶出法のこれらの 2 つのバリエーション 3′ 端にヒストン Mrna を劈開 U7 snRNP に依存した処理の複合体の浄化のためテストされ、彼らは両方証明以前他に好意的に比較する精製方法を開発しました。UV 溶出サンプルには、主要な蛋白質の汚染物の無料され、質量分析法と機能アッセイによる直接分析に適した U7 snRNP の容易に検出可能な量が含まれています。この方法は、容易に他の RNA 結合の複合体の浄化のために適応し、DNA に固有の蛋白質と高分子複合体を浄化するために単一および二重鎖 DNA 結合部位と組み合わせて使用できます。
Introduction
真核生物の RNA ポリメラーゼ II によって生成された mRNA 前駆体 (Mrna) は細胞質でのタンパク質合成のための完全に機能の mRNA テンプレートになる前に核の成熟イベントがいくつかを受けます。これらのイベントの 1 つは、3′ 端処理です。Mrna の大半には、3′ 端処理には胸の谷間に起こる結合が含まれます。この 2 段階の反応は比較的豊富な複合体によって触媒以上 15 の蛋白質1から成る。動物レプリケーション依存性ヒストン Mrna は 3′ 末端で U7 snRNP、U7 に snRNA の ~ 60 のヌクレオチドと複数タンパク質2,3から成る複雑な低豊富で、重要な役割を果たした別の機構によって処理されます。.ヒストン mRNA と U7 snRNP のサブユニットの 1 つの特定のシーケンスで U7 に snRNA 塩基対が開裂反応を触媒する、成熟したヒストンを生成せず、多 mRNA 尾します。ヒストン mRNA の 3′ 端処理も必要と茎ループ結合タンパク質 (SLBP)、保存された茎ループの位置を結合する胸の谷間サイトの上流と基板2,3U7 snRNP の募集を強化します。目的で U7 snRNP の個々 のコンポーネントを識別する研究は、動物細胞で U7 snRNP の低濃度として分離または使用した結果浄化中に部分的な分解を受ける複合体の傾向のために挑戦されています。中性洗剤4,5,6、高い塩の洗浄および/または複数のクロマト グラフの手順7,8,9。
最近、U7 に依存した処理機械の組成を決定するヒストン mRNA が 3′ または 5′ でビオチンを含むの短い断片だった核エキスと培養および組み立ての複合体は、ストレプトアビジン コーティングで捕えられました。アガロース ビーズ5,6,10。ビオチンとストレプトアビジンの非常に強力な相互作用のためストレプトアビジン ビーズに固定化した蛋白質は SDS の沸騰によって条件の変化の下で溶出され銀製の汚損及び質量分析法によって分析します。比較的粗サンプル、しばしば多数の背景蛋白質特異的行きの可能性のいくつかのコンポーネントをマスキング、ストレプトアビジン ビーズ混入が得られた一方、この単純なアプローチは、U7 snRNP のコンポーネントの数を識別加工機械と銀の検出を防止する染色ゲル5,6,10。重要なは、このアプローチはまた追加のメソッドによって分離材料と同質性にさらに精製機能研究を排除しました。
ビオチン/ストレプトアビジン相互作用には、いずれかの相互作用を弱めるかで化学分解スペーサー アームを提供するために設計されているそれらのほとんどの事実上不可逆的な性質に対処するため時間の経過と共に変更の数を提案した、ビオチンを含む試薬11,12。すべてのこれらの変更の欠点は、彼らが著しく整合性または浄化された蛋白質の活動を危険にさらす、溶出のステップ中にメソッドおよび/または多くの場合必要な非生理的条件の効率を減らすことだった。
ここでは、固有の問題を解決する別のアプローチについて述べる RNA を用いたビオチン/ストレプトアビジン戦略の 5 ‘ ビオチンが共有結合に接続された基板を経由で終了写真分解 1-(2-ニトロフェニル) はエチル基UV13,14を長波長に敏感。我々 はショウジョウバエから制限 U7 依存処理機械の浄化のためのこのアプローチをテストし、哺乳類の核抽出15。ヒストン mRNA 含んでいるビオチンの短い潜伏と核エキスで写真分解のリンカー、組み立て加工団地のストレプトアビジン ビーズに固定化した、徹底的に洗って、やさしくネイティブ ソリューションをリリース~ 360 nm の紫外線ライトへの露出によってフォーム。UV 溶出方法は非常に効率的、迅速かつ簡単な U7 snRNP エキス15として 100 μ L から染色スライバーでそのコンポーネントを視覚化するための十分な量を収穫します。UV 溶出素材は背景蛋白質の無料直接質量分析、追加精製工程、酵素アッセイに最適です。同じメソッドは、比較的短い RNA 結合部位を必要とする他の RNA ・ タンパク質複合体の精製に採用されることがあります。ビオチンと写真分解リンカーも共有可能にシングル- と二本鎖 DNA の可能性のある様々 な DNA/タンパク質複合体の精製の UV 溶出法を拡張します。
ビオチンが共有結合を含む RNA 基板の化学合成に接続されているし、写真分解のリンカーで高価になり大幅に長い系列を非効率的な 〜 65 ヌクレオチドを超えないようにシーケンスのみ実用的ですが。この問題に対処するため、はるかに長い RNA バインディング ターゲットに適している方法を開発しました。このアプローチで任意の長さとヌクレオチドのシーケンスの RNA は生成された体外T7 または sp6 によってトランスクリプションによって、ビオチンおよび 5′ 端 (トランスで写真分解のリンカーを含む短い相補的なオリゴヌクレオチドをアニールしました。構成)。結果二重個々 結合蛋白質または共有添付写真分解のビオチンを含む RNA の培地について同じプロトコルに従うストレプトアビジン ビーズの高分子複合体の浄化に使用後 (cis構成)。この変更には、UV 溶出の広範な範囲の RNA ・ タンパク質精製法の拡張のヌクレオチドの数百を含む体外生成成績と組み合わせて写真分解のビオチンを使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は簡単で、写真分解のリンカーを組み込むほか、UV 溶出のステップはビオチンとストレプトアビジンの非常に強い相互作用を活用する一般的に使用されるメソッドから違いはありません。UV 溶出のステップは非常に効率的で、通常固定化 RNA の 75% 以上をリリース、ストレプトアビジン ビーズ、ビーズに非特異に結合するタンパク質の高いバック グラウンドを残してから?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
同僚と協力者の貢献のために我々 の仕事に感謝します。この研究は、NIH によって支えられた GM 29832 を付与します。
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
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