Enkeltsteg rensing av Macromolecular komplekser ved hjelp av RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker
Summary
RNA/protein komplekser renset med botin-streptavidin strategi er elut til løsningen under denaturing forhold i et skjema som er uegnet for ytterligere rensing og funksjonell analyse. Her beskriver vi en endring av denne strategien som benytter et foto-cleavable linker i RNA og en mild UV-elueringsrør trinn, gir native og funksjonell RNA/protein komplekser.
Abstract
I mange år, blitt det eksepsjonelt sterke og raskt dannet samspillet mellom biotin og streptavidin ble benyttet for delvis rensing av biologisk viktig RNA/protein komplekser. Men denne strategien lider en stor ulempe som begrenser dens bredere utnyttelse: biotin/streptavidin samspillet kan brytes under denaturing som også forstyrre integriteten til eluted komplekser, dermed utelukker deres påfølgende funksjonell analyse og/eller ytterligere rensing med andre metoder. I tillegg er eluted prøvene ofte forurenset med bakgrunn proteiner som nonspecifically knytter streptavidin perler, kompliserer analyse av renset komplekser av sølv flekker og massespektrometri. For å overvinne disse begrensningene, vi utviklet en variant av biotin/streptavidin strategi som biotin er knyttet til en RNA substrat via et foto-cleavable linker og komplekser immobilisert på streptavidin perler er selektivt elut til løsningen i en opprinnelige form av langbølget UV, forlater bakgrunn proteiner på perlene. Kortere RNA bindende underlag kan syntetiseres kjemisk biotin og foto-cleavable linker covalently festet til 5 av de mens lengre RNA underlag kan leveres med de to gruppene av et utfyllende oligonucleotide. Disse to varianter av metoden UV-elueringsrør testet for rensing av U7 snRNP avhengig av behandling komplekser som cleave histone pre-mRNAs på 3 slutten og begge viste sammenligne gunstig til andre tidligere utviklet metoder for rensing. UV-elut prøvene inneholdt lett synlig mengder U7-snRNP som var uten større protein forurensninger og egnet for direkte analyse av massespektrometri og funksjonelle analyser. Metoden beskrevet kan lett tilpasses for rensing av andre RNA bindende komplekser og brukes sammen med single – og double-strandet DNA bindende for å rense DNA-spesifikke proteiner og macromolecular komplekser.
Introduction
I eukaryoter gjennomgå RNA polymerase II-generert mRNA prekursorer (pre-mRNAs) flere modning hendelser i kjernen før de blir fullt funksjonell mRNA maler for proteinsyntese i cytoplasma. En av disse hendelsene er 3 slutten behandling. For de aller fleste av pre-mRNAs innebærer 3 slutten behandling cleavage koblet til polyadenylation. Denne totrinns reaksjon er katalysert av et relativt rikelig kompleks som består av mer enn 15 proteiner1. Dyr replikering-avhengige histone pre-mRNAs behandles på 3 slutten av en annen mekanisme der den sentrale rollen spilles av U7 snRNP, en lav overflod består av U7 snRNA ~ 60 nukleotider og flere proteiner2,3 . U7 snRNA base parene med en bestemt sekvens i histone pre-mRNA og en av underenheter av U7-snRNP gir cleavage reaksjonen, genererer eldre histone mRNA uten en poly(A) hale. 3 slutten behandling av histone pre-mRNA krever også stilk-Loop bindende Protein (SLBP), som binder en bevart stilk-loop ligger over webområdet cleavage og forbedrer rekruttering av U7-snRNP til underlaget2,3. Studier identifisere individuelle komponenter av U7-snRNP har vært utfordrende på grunn av lav konsentrasjon av U7-snRNP i dyreceller og tendensen til komplisert å distansere eller gjennomgå delvis proteolyse under renselsen ved å bruke milde vaskemidler4,5,6, høy salt vasker og/eller flere brukt kromatografiske trinn7,8,9.
Nylig for å bestemme sammensetningen av U7-avhengige produksjonsutstyr, et kort fragment av histone pre-mRNA inneholder biotin 3 eller 5′ ble inkubert med en kjernefysisk ekstrakt og sammensatte komplekser ble tatt på streptavidin-belagt agarose perler5,6,10. Eksepsjonelt sterke samhandling mellom biotin og streptavidin, var proteiner immobilisert på streptavidin perler elut under denaturing forhold ved koking i SDS og analyseres av sølv flekker og massespektrometri. Mens denne enkle tilnærming identifisert en rekke komponenter av U7-snRNP, ga det relativt grov prøver, ofte forurenset med et stort antall bakgrunn proteiner nonspecifically bundet til streptavidin perler, potensielt maskering noen av komponentene produksjonsutstyr og hindre gjenkjenningen på sølv farget gels5,6,10. Viktigere, utelukket denne tilnærmingen også alle funksjonelle studier med isolert materialet og rensing sin videre til homogenitet av flere metoder.
En rekke endringer ble foreslått over tid å ta nesten uhelbredelig natur biotin/streptavidin samhandling, med de fleste av dem blir utformet å enten svekke samspillet eller gi en kjemisk cleavable spacer arm i den biotin inneholder reagenser11,12. Ulempen med alle disse endringene var at reduserer effektiviteten av metoden eller ofte krever ikke-fysiologiske forhold under elueringsrør trinnet, jeopardizing enten integritet eller aktivitet av renset proteiner.
Her beskriver vi en annen tilnærming for å løse iboende problemet av biotin/streptavidin strategi ved hjelp av RNA underlag som biotin er covalently knyttet til 5′ ende via en foto-cleavable 1-(2-nitrophenyl) ethyl moiety som er følsom for lenge bølge UV13,14. Vi testet denne tilnærmingen for rensing av begrensende U7-avhengige behandling maskiner fra Drosophila og pattedyr kjernefysiske ekstrakter15. Etter en kort inkubering av histone pre-mRNA inneholder biotin og foto-cleavable linker med en kjernefysisk ekstrakt, samlet behandling komplekser er immobilisert på streptavidin perler, grundig vasket og forsiktig ut til løsningen i opprinnelig form av 360 nm UV lyseksponering. UV-elueringsrør metoden er svært effektiv, rask og enkel, gir tilstrekkelig mengder U7-snRNP å visualisere komponentene av sliver flekker fra så lite som 100 µL av ekstrakt15. UV-elut materialet er gratis bakgrunn proteiner og egnet for direkte massespektrometri analyse, flere rensing trinnene og enzymatiske analyser. Samme metode kan vedtas for rensing av andre RNA/protein komplekser som krever relativt kort RNA bindende områder. Biotin og foto-cleavable linker kan også covalently knyttes til single – og double-strandet DNA, kan utvide UV-elueringsrør metoden for rensing av ulike DNA/protein komplekser.
Syntese av RNA underlag som inneholder covalently vedlagt biotin og foto-cleavable linker er praktisk bare med sekvensene som ikke overstiger ~ 65 nukleotider, bli dyrt og ineffektivt for betydelig lengre sekvenser. For å løse dette problemet, utviklet vi også en alternativ tilnærming som passer for mye lengre RNA forpliktende mål. I denne tilnærmingen, RNA av alle lengden og nukleotid er generert i vitro med T7 eller SP6 transkripsjon og herdet til en kort utfyllende oligonucleotide som inneholder biotin og foto-cleavable linker nederst 5′ (trans konfigurasjon). Resulterende duplex blir brukt å rense personlige bindende proteiner eller macromolecular komplekser på streptavidin perler følger samme protokollen på RNA substrater som inneholder bilde-cleavable biotin knyttet covalently (cis konfigurasjon). Med denne endringen, kan Foto-cleavable biotin brukes sammen med i vitro generert utskrifter som inneholder hundrevis av nukleotider, utvide UV-elueringsrør metoden for rensing av et bredt utvalg av RNA/protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet her er enkel og dessuten omfatter et foto-cleavable linker og UV-elueringsrør trinnet avvike ikke fra de vanligste bruke metodene som utnytter den ekstremt sterke vekselvirkningen mellom biotin og streptavidin. UV-elueringsrør trinnet er veldig effektivt, vanligvis ut mer enn 75% av de immobilisert og tilhørende proteiner fra streptavidin perler, etterlot seg en høy bakgrunn av proteiner som nonspecifically binder til perler. Ved å eliminere denne bakgrunnen, gir UV-elueringsrør trinnet bemerkelse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker våre kolleger og samarbeidspartnere for deres bidrag til vårt arbeid. Denne studien ble støttet av NIH gi GM 29832.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d’Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3′ end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 ‘-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 ‘-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2′- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 ‘-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5′-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ‘ exonuclease that specifically interacts with the 3 ‘ end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3’hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3’hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3′ end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ‘ end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L’Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3′ end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
