クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用
Summary
本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。
Abstract
クリプトコッカス感染をシミュレートするために、環境中のクリプトコッカス細胞の自然捕食者であるアメーバをマクロファージのモデルとして使用することができます。この捕食生物は、マクロファージと同様に、内在細胞を殺すために食細胞細胞症を採用している。共焦点レーザー走査顕微鏡の助けを借りて、クリプトコッカス細胞とアメーバの間のインタラクティブな瞬間を描いた画像がキャプチャされます。電子顕微鏡の分解能はまた、アメーバ食品の真空中に閉じ込められたときにクリプトコッカス細胞の超構造的な詳細を明らかにするのに役立ちます。咽頭症は連続的なプロセスであるため、定量的なデータを分析に統合して、画像がキャプチャされた時点で何が起こるかを説明します。具体的には、クリプトコッカス細胞の内部化におけるアメーバの効率を定量するために相対蛍光単位が読み取られる。この目的のために、クリプトコッカス細胞は、食品真空の酸性環境の中に一度閉じ込められた蛍石を作る色素で染色されます。このような技術を通じて収集された情報は、アメーバによって内部化された場合、および場合によっては他の食細胞によって細胞の挙動と運命に関する結論を導き出すのに役立つ重要な情報を提供することができます。
Introduction
微生物は、土壌と水の開いた物理的境界などの異なる生態学的ニッチを占有し、繁栄するために時間をかけて進化してきました。これらのニッチでは、微生物はしばしば限られた資源のための直接競争に従事します。重要なことは、彼らが拡大する人口2、3を収容するために必要な成長または空間をサポートするために使用する栄養素のために。特定の例では、アメーバのようないくつかのホロゾニック生物は、バイオマス4、5から栄養素を抽出する方法としてクリプトコッカス細胞に先行することさえある。その結果、このような生物は、獲物の個体数を制御することにより、領土の支配を確立することができます。この捕食圧のために、一部の獲物は、圧力の負の影響を和らめるために、クリプトコッカスカプセル6などの微生物因子を生成するために選択されてもよい。しかし、この圧力の意図しない結果として、一部の微生物は、種の障壁を越え、栄養素が豊富で理想を持つ人体の限られた空間のように、7を植民地化するための新しいニッチを探し出すことを可能にする因子を獲得する。条件。後者は、クリプトコッカスのような地上微生物がどのように説明するか(C.)ネオフォーマンは病原性に変容する可能性があります。
そのためには、クリプトコッカス細胞がアメーバと共に持つ可能性のある初期接触と、これが病原性になるためにそれらを選択する方法を研究することが重要です。より具体的には、これは、感染中にマクロファージによって作用したクリプトコッカス細胞がどのように動作するかの手がかりを与える可能性があります。アメーバは、研究室8でアメーバの培養を比較的安価で維持しやすいため、マクロファージのモデルとして選ばれたのはこのためです。興味深いのは、クリプトコッカス二次代謝産物viz.3−ヒドロキシ脂肪酸9、10がアメーバとクリプトコッカス細胞との相互作用にどのように影響するかを調べることであった。
アメーバとその獲物と肉眼との相互作用を知覚する簡単な方法は、寒天プレートとスポットアメーバの表面に獲物を使用して芝生を作成することです。寒天プレート上のプラークまたはクリアゾーンの視覚化は、アメーバが獲物に餌を与えた可能性のある領域を示しています。しかし、このマクロレベルでは、プロセスの結果のみが指摘され、咽頭細胞症が機械化される過程は観察できない。したがって、細胞間ベースでプロセスを評価するために、11、12を使用することができるいくつかの顕微鏡的方法がある。例えば、インキュベーションチャンバを有する反転顕微鏡は、咽頭細胞とその標的13との間の事象のタイムラプスを記録するために使用することができる。残念ながら、タイムラプス機能を備えた顕微鏡のコストのために、実験室は、特にリソースの貧弱な設定で、このような顕微鏡を購入することが常に可能であるとは限りません。
上記の制限を回避するために、本研究は、C.ネオフォルマンスviz C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378とC.ネオフォルマンスLMPE 046とアカンタモエバ・カステラニとの相互作用を評価する順次探索的設計を提示する。.まず、定量的方法に先行する定性的な方法が用いられる。静止画は、反転蛍光顕微鏡と透過電子顕微鏡を使用して撮影され、アメーバ-クリプトコッカス相互作用を描写します。続いて、プレートリーダーを用いて蛍光を定量し、クリプトコッカス細胞を内部化するアメーバの効率を推定した。データ解釈段階でこれらの方法から得られた結果を調整する場合、これは、咽頭細胞症のタイムラプスビデオを熟読するのと同じくらい重要な情報を明らかにする可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
論文では、アメーバがクリプトコッカス細胞と相互作用する際に生じる可能性のある結果を明らかにするために、さまざまな技術がうまく用いられた。また、クリプトコッカス-アメーバ相互作用の結果に対する3-ヒドロキシ脂肪酸の影響を示すことに興味を持った。
最初に使用された技術は、静止画をレンダリングした共焦点顕微鏡検査でした。ここでのこの手?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、南アフリカ国立研究財団(助成番号:UID 87903)と自由国家大学からの助成金によって支援されました。また、顕微鏡検査研究中にピーター・ヴァン・ワイクとハンリー・グロブラーが提供するサービスと支援にも感謝しています。
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
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