Supplerende anvendelse af mikroskopiske teknikker og fluorescens aflæsning i studiet af Cryptococcus-Amoeba interaktioner
Summary
Dette papir beskriver en protokol til forberedelse af en co-kultur af kryptokok-celler og amobers, der er undersøgt ved hjælp af Still, fluorescerende billeder og høj opløsning transmission Electron mikroskop billeder. Illustreret her er, hvordan kvantitative data kan supplere sådanne kvalitative oplysninger.
Abstract
For at simulere Cryptococcus infektion, Amoeba, som er den naturlige rovdyr af kryptokok-celler i miljøet, kan bruges som en model for makrofager. Denne rovfisk organisme, svarende til makrofager, beskæftiger fagocytose at dræbe internaliserede celler. Ved hjælp af en confokal laser-scanning mikroskop, billeder, der skildrer interaktive øjeblikke mellem kryptokok-celler og amøbe er fanget. Opløsnings kraften i elektronmikroskopet hjælper også med at afsløre de ultrastrukturelle detaljer af kryptokok–celler, når de fanges inde i amøbe Food vakuole. Da fagocytose er en kontinuerlig proces, er kvantitative data derefter integreret i analysen for at forklare, hvad der sker på tidspunktet, når et billede er fanget. For at være specifik læses relative fluorescens enheder for at kvantificere amoebas effektivitet i internalisering af kryptococcal-celler. Til dette formål, kryptokok-celler er farvet med et farvestof, der gør dem fluorescerer når fanget inde i det sure miljø af fødevarer vakuole. Når de anvendes sammen, oplysninger indsamlet gennem sådanne teknikker kan give kritiske oplysninger til at hjælpe med at drage konklusioner om adfærd og skæbne af celler, når internaliseret af amøbe og, muligvis, af andre fagocytiske celler.
Introduction
Mikrober har udviklet sig over tid til at besætte og trives i forskellige økologiske nicher såsom de åbne fysiske grænser for jord og vand, blandt andre1. I disse nicher engagerer mikrober sig ofte i den direkte konkurrence om begrænsede ressourcer; vigtigere, for næringsstoffer, som de bruger til at støtte deres vækst eller plads, som de har brug for at imødekomme den voksende befolkning2,3. I visse tilfælde, nogle holozoiske organismer som amøbe kan endda prædate på kryptokok-celler som en måde at udtrække næringsstoffer fra deres biomasse4,5. Dette gør det muligt for sådanne organismer at etablere territorial dominans ved at kontrollere befolkningstallet for dets bytte. På grund af dette underbuds pres kan nogle bytte blive udvalgt til at producere mikrobielle faktorer, såsom kryptokok-Capsule6, for at forene de negative virkninger af trykket. Men som en utilsigtet konsekvens af dette pres, nogle mikrober erhverve faktorer, der giver dem mulighed for at krydse arten barriere og opsøge nye nicher at kolonisere7, ligesom de lukkede rum i den menneskelige krop, der er rige på næringsstoffer og har ideelle Betingelser. Sidstnævnte kan forklare, hvordan en terrestrisk mikrobe som Cryptococcus (C.) neoformans kan omdanne til at blive sygdomsfremkaldende.
Til dette formål er det vigtigt at studere den indledende kontakt, som kryptokok-celler kan have med amøbe og hvordan dette kan vælge dem til at blive sygdomsfremkaldende. Mere specifikt, dette kan give fingerpeg om, hvordan kryptokok-celler opfører sig, når handlet på af makrofager under infektion. Det er grunden til, at amøbe blev valgt som model for makrofager her, da det er relativt billigt og let at opretholde en kultur af amøbe i et laboratorium8. Af interesse var også at undersøge, hvordan kryptokok-sekundære metabolitter Viz. 3-hydroxy fedtsyrer9,10 påvirke samspillet mellem amobers og kryptokok-celler.
En enkel måde at opfatte samspillet mellem amøbe og dets bytte med det blotte øje er at skabe en græsplæne ved hjælp af sit bytte på overfladen af en agar plade og spot amøbe. Visualisering af plaques eller klare zoner på agar pladen skildrer områder, hvor amøbe kan have fodret med sit bytte. Men på dette makroniveau, kun resultatet af processen er noteret, og processen med fagocytose er mekaniseret ikke kan observeres. Derfor, at værdsætte processen på en celle-til-celle basis, der er flere mikroskopiske metoder, der kan anvendes11,12. For eksempel kan et inverteret mikroskop med et inkubations kammer bruges til videooptagelse af en tidsforskydning af hændelser mellem en Fagocytisk celle og dens mål13. Desværre, på grund af omkostningerne ved et mikroskop med en tidsforskudt funktionalitet, er det ikke altid muligt for laboratorier at købe et sådant mikroskop, især i ressourcefattige-indstillinger.
For at omgå ovennævnte begrænsning, denne undersøgelse præsenterer en sekventiel sonderende design, der evaluerer samspillet mellem C. neoformans Viz C. neoformans uofs Y-1378 og C. neoformans Lmpe 046 med acanthamoeba Castellani . For det første anvendes en kvalitativ metode, der går forud for en kvantitativ metode. Stillbilleder optages ved hjælp af en inverteret fluorescens mikroskop, samt et transmission elektronmikroskop til at skildre Amoeba-Cryptococcus interaktioner. Dette blev efterfulgt af kvantificering af fluorescens ved hjælp af en plade læser til at estimere effektiviteten af amøbe til internalisere kryptokok-celler. Når du forener resultater fra disse metoder under data-fortolkning fase, dette kan lige så afsløre så meget kritiske oplysninger som perusing en fagocytose time-lapse video.
Protocol
Representative Results
Discussion
I avisen blev forskellige teknikker med succes anvendt til at afsløre det mulige udfald, der kan opstå, når amøbe interagerer med kryptokok-celler. Også, vi var interesseret i at vise virkningerne af 3-hydroxy fedtsyrer på resultatet af Cryptococcus-Amoeba interaktioner.
Den første anvendte teknik var confokal mikroskopi, som gjorde stillbilleder. Den største ulempe ved denne teknik her var, at det kun gav os oplysninger, der er begrænset til et bestemt tidspunkt. Enhver konk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af et tilskud fra Sydafrikas National Research Foundation (tilskudsnummer: UID 87903) og universitetet i Free State. Vi er også taknemmelige for tjenester og assistance, der tilbydes af Pieter van Wyk og Hanlie Grobler under vores mikroskopi undersøgelser.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
