क्रिप्टोकॉकस-अमीबा इंटरेक्शन के अध्ययन में सूक्ष्म तकनीक और फ्लोरोसेंट रीडिंग का पूरक उपयोग
Summary
इस कागज क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं और अमीबा कि अभी भी, फ्लोरोसेंट छवियों और उच्च संकल्प संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग कर अध्ययन किया जाता है की एक सह संस्कृति तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल विवरण. यहाँ सचित्र है कि कैसे मात्रात्मक डेटा ऐसी गुणात्मक जानकारी पूरक कर सकते हैं.
Abstract
क्रिप्टोकॉकस संक्रमण का अनुकरण करने के लिए, अमीबा, जो पर्यावरण में क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं का प्राकृतिक शिकारी है, मैक्रोफेज के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। मैक्रोफेज के समान यह हिंसक जीव आंतरिक कोशिकाओं को मारने के लिए शिगोसाइटोसिस को रोजगार देता है। एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की सहायता के साथ, क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं और अमीबा के बीच इंटरैक्टिव क्षणों का चित्रण छवियों पर कब्जा कर रहे हैं. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की संकल्प शक्ति भी क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के ultrastructural विस्तार प्रकट करने में मदद करता है जब अमीबा खाद्य धानी के अंदर फंस. चूंकि phagocytosis एक सतत प्रक्रिया है, मात्रात्मक डेटा तो विश्लेषण में एकीकृत है समझाने के लिए क्या समय बिंदु पर होता है जब एक छवि पर कब्जा कर लिया है. विशिष्ट होना करने के लिए, रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं internalizing में अमीबा की दक्षता की मात्रा निर्धारित करने के लिए पढ़ रहे हैं। इस उद्देश्य के लिए, क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को एक डाई के साथ दागा जाता है जो उन्हें एक बार भोजन धानी के अम्लीय वातावरण के अंदर फंस गया है। जब एक साथ इस्तेमाल किया, इस तरह की तकनीकों के माध्यम से एकत्र की गई जानकारी महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने में मदद करने के व्यवहार और कोशिकाओं के भाग्य पर निष्कर्ष आकर्षित जब अमीबा द्वारा internalized और, संभवतः, अन्य phagocytic कोशिकाओं द्वारा कर सकते हैं.
Introduction
समय के साथ-साथ विभिन्न पारिस्थितिक स्थानों जैसे मिट्टी और जल की खुली भौतिक सीमाओं, अन्य1के बीच में, पर कब्जा करने और फलने-फूलने के लिए सूक्ष्म जीव विकसित हुए हैं। इन niches में, रोगाणुओं अक्सर सीमित संसाधनों के लिए प्रत्यक्ष प्रतियोगिता में संलग्न; महत्वपूर्ण बात यह है कि पोषक तत्वों के लिए जो वे अपने विकास या स्थान का समर्थन करने के लिए उपयोग करते हैं, जिन्हें उन्हें बढ़ती हुई जनसंख्या2,3को समायोजित करने की आवश्यकता है . कुछ उदाहरणों में, अमीबा जैसे कुछ होलोजोइक जीव भी क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं पर उनके बायोमास से पोषक तत्वों को निकालने के एक तरीके के रूप में predate कर सकते हैं4,5. बदले में, यह ऐसे जीवों को अपने शिकार की जनसंख्या संख्या को नियंत्रित करने के माध्यम से क्षेत्रीय प्रभुत्व स्थापित करने की अनुमति देता है। इस हिंसक दबाव के कारण, कुछ शिकार माइक्रोबियल कारकों का उत्पादन करने के लिए चुना जा सकता है, जैसे क्रिप्टोकोकल कैप्सूल6, दबाव के नकारात्मक प्रभावों का समाधान करने के लिए। हालांकि, इस दबाव का एक अनपेक्षित परिणाम के रूप में, कुछ रोगाणुओं कारक है कि उन्हें प्रजातियों बाधा पार करने के लिए और7उपनिवेश के लिए नए niches बाहर की तलाश करने की अनुमति प्राप्त, मानव शरीर के सीमित रिक्त स्थान है कि पोषक तत्वों में समृद्ध हैं और आदर्श है की तरह शर्तों. बाद की व्याख्या कर सकते हैं कैसे एक स्थलीय microbe की तरह क्रिप्टोकॉकस (सी.) नियोफॉर्ममैन रोगजनक बनने के लिए बदल सकते हैं।
इस अंत में, क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के अमीबा के साथ हो सकता है कि प्रारंभिक संपर्क का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह रोगजनक बनने के लिए उन्हें कैसे चुन सकता है। अधिक विशेष रूप से, यह कैसे क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं व्यवहार जब संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज द्वारा पर कार्रवाई पर सुराग दे सकता है. यही कारण है कि अमीबा को यहाँ मैक्रोफेज के लिए एक मॉडल के रूप में चुना गया था, क्योंकि प्रयोगशाला8में अमीबा की संस्कृति को बनाए रखना अपेक्षाकृत सस्ता और आसान है। ब्याज की भी जांच करने के लिए कैसे क्रिप्टोकोकल माध्यमिक चयापचयों अर्थात् 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड9,10 अमीबा और क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के बीच बातचीत को प्रभावित किया गया था।
अमीबा और नग्न आंखों के साथ अपने शिकार के बीच बातचीत perceiving का एक सरल तरीका एक agar प्लेट और हाजिर अमीबा की सतह पर अपने शिकार का उपयोग कर एक लॉन बनाने के लिए है। आगर प्लेट पर प्लेक या क्लियर ज़ोन का दृश्य उन क्षेत्रों को दर्शाता है जहां अमीबा अपने शिकार पर खिलाया जा सकता है। हालांकि, इस स्थूल स्तर पर, केवल प्रक्रिया के परिणाम का उल्लेख किया जाता है, और phagocytosis की प्रक्रिया यंत्रीकृत है नहीं देखा जा सकता है. अतः कोशिका-से-कोशिका आधार पर प्रक्रिया की कदर करने के लिए अनेक सूक्ष्म प्रविधियां हैं जिनका उपयोग11,12किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ऊष्मायन कक्ष के साथ एक उल्टे सूक्ष्मदर्शी का उपयोग एक फैबसाइटिक सेल और उसके लक्ष्य13के बीच की घटनाओं के समय-चूक को वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, एक समय चूक कार्यक्षमता के साथ एक माइक्रोस्कोप की लागत के कारण, प्रयोगशालाओं के लिए इस तरह के एक माइक्रोस्कोप खरीद करने के लिए हमेशा संभव नहीं है, विशेष रूप से संसाधन गरीब सेटिंग में.
उपरोक्त सीमा को दरकिनार करने के लिए, यह अध्ययन एक अनुक्रमिक अन्वेषणात्मक डिजाइन प्रस्तुत करता है जो सी नियोफोरमैन्स की बातचीत का मूल्यांकन करता है, अर्थात सी नियोफोमन्स यूओएफ एस वाई-1378 और सी नियोफोरमैन एलएमपीई 046 के साथ Acanthamoeba castellani . सबसे पहले, एक गुणात्मक विधि का उपयोग किया जाता है जो मात्रात्मक विधि से पहले होता है। अभी भी छवियों एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर रहे हैं, साथ ही एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप अमीबा-क्रिप्टोकॉकस बातचीत को दर्शाती है. इसके बाद क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को आंतरिक बनाने के लिए अमीबा की दक्षता का अनुमान लगाने के लिए प्लेट रीडर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट की मात्रा निर्धारित की गई। जब डेटा व्याख्या चरण के दौरान इन तरीकों से निष्कर्षों का मिलान, यह समान रूप से एक phagocytosis समय चूक वीडियो perusing के रूप में के रूप में ज्यादा महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट कर सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
कागज में, विभिन्न तकनीकों को सफलतापूर्वक संभव परिणाम है कि पैदा हो सकता है जब अमीबा क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के साथ बातचीत प्रकट करने के लिए नियोजित किया गया. इसके अलावा, हम क्रिप्टोकॉकस-अमीबा बातचीत …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम दक्षिण अफ्रीका के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान संख्या: UID 87903) और मुक्त राज्य के विश्वविद्यालय. हम भी सेवाओं और हमारे माइक्रोस्कोपी अध्ययन के दौरान पीटर वैन Wyk और Hanlie Grobler द्वारा की पेशकश की सहायता के लिए आभारी हैं.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
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