Kompletterande användning av mikroskopiska tekniker och fluorescens läsning i studera Cryptococcus-amoeba interaktioner
Summary
Detta dokument specificerar ett protokoll för att förbereda en co-kultur av kryptokockmeningit celler och amöbor som studeras med hjälp av stillbilder, fluorescerande bilder och högupplöst överföring elektronmikroskop bilder. Illustrerad här är hur kvantitativa data kan komplettera sådan kvalitativ information.
Abstract
För att simulera Cryptococcus infektion, amoeba, som är den naturliga rovdjur av kryptokockmeningit celler i miljön, kan användas som en modell för makrofager. Denna rovgiriga organism, liknande makrofager, sysselsätter fagocytos att döda internaliserade celler. Med hjälp av en konfokal laserskanning Mikroskop, bilder som skildrar interaktiva stunder mellan kryptokockmeningit celler och amoeba fångas. Upplösningen makt elektronmikroskop hjälper också till att avslöja ultrastrukturella detalj av kryptokockmeningit celler när fångade inne i amoeba Food vacuole. Eftersom fagocytos är en kontinuerlig process, kvantitativa data integreras sedan i analysen för att förklara vad som händer vid tidpunkten när en bild fångas. För att vara specifika, relativa fluorescensenheter läses för att kvantifiera effektiviteten av amoeba i internalisera kryptokockmeningit celler. För detta ändamål, kryptokockmeningit celler färgas med ett färgämne som gör dem fluorescerar en gång fångade inuti den sura miljön i maten vacuole. När de används tillsammans, information som samlats in genom sådana tekniker kan ge kritisk information för att dra slutsatser om beteendet och ödet för celler när internaliseras av amoeba och, möjligen, av andra Fagocytos celler.
Introduction
Mikrober har utvecklats med tiden för att ockupera och frodas i olika ekologiska nischer som de öppna fysiska gränserna för jord och vatten, bland annat1. I dessa nischer ägnar sig mikrober ofta åt direkt konkurrens om begränsade resurser. viktigt, för näringsämnen som de använder för att stödja deras tillväxt eller utrymme, som de behöver för att rymma den expanderande befolkningen2,3. I vissa fall, vissa holozoic organismer som amoeba kan även föregår på kryptokockmeningit celler som ett sätt att utvinna näringsämnen från deras biomassa4,5. Detta tillåter i sin tur sådana organismer att etablera territoriell dominans genom att kontrollera befolkningsantalet för sitt byte. På grund av denna underprissättning, vissa byten kan väljas för att producera mikrobiella faktorer, såsom kryptokockmeningit kapsel6, att förena de negativa effekterna av trycket. Men som en oavsiktlig konsekvens av detta tryck, vissa mikrober förvärva faktorer som gör det möjligt för dem att korsa arten barriären och söka nya nischer att kolonisera7, liksom trånga utrymmen i den mänskliga kroppen som är rika på näringsämnen och har perfekt Villkor. Den senare kan förklara hur en terrestrial mikrob som Cryptococcus (C.) neoformans kan omvandla för att bli patogena.
För detta ändamål är det viktigt att studera den initiala kontakt som kryptokockmeningit celler kan ha med amoeba och hur detta kan välja dem att bli patogena. Mer specifikt kan detta ge ledtrådar om hur kryptokockmeningit celler beter sig när agerat på av makrofager under infektion. Det är av denna anledning som amoeba valdes som modell för makrofager här, eftersom det är relativt billigt och lätt att underhålla en kultur av amoeba i ett laboratorium8. Av intresse var att också undersöka hur kryptokockmeningit sekundära metaboliter dvs. 3-hydroxy fettsyror9,10 påverka samspelet mellan amöbor och kryptokockmeningit celler.
Ett enkelt sätt att uppfatta samspelet mellan amoeba och dess bytesdjur med blotta ögat är att skapa en gräsmatta med sitt byte på ytan av en agar tallrik och fläck Amoeba. Visualisering av plack eller tydliga zoner på agarplattan skildrar områden där amoeba kan ha utfodrat sitt byte. Men på denna makro nivå, endast resultatet av processen noteras, och processen för fagocytos är mekaniserad kan inte observeras. Därför, för att uppskatta processen på cell-till-cell basis, det finns flera mikroskopiska metoder som kan användas11,12. Till exempel kan ett inverterat Mikroskop med en inkubations kammare användas för att videospela in en tidsfördröjning av händelser mellan en fagocytisk cell och dess mål13. Tyvärr, på grund av kostnaden för ett Mikroskop med en tid-lapse funktionalitet, är det inte alltid möjligt för laboratorier att köpa ett sådant Mikroskop, särskilt i resursfattiga-inställningar.
För att kringgå ovanstående begränsning, presenterar denna studie en sekventiell undersökande design som utvärderar interaktionen mellan c. neoformans VIZ c. neoformans uofs Y-1378 och C. neoformans Lmpe 046 med acanthamoeba Castellani . För det första används en kvalitativ metod som föregår en kvantitativ metod. Stillbilder fångas med hjälp av en inverterad fluorescens Mikroskop, samt ett transmissionselektronmikroskop för att skildra amoeba-Cryptococcus interaktioner. Detta följdes av kvantifiera fluorescens med hjälp av en Plattläsare för att uppskatta effektiviteten av amoeba att internalisera kryptokockmeningit celler. Vid avstämning av resultaten från dessa metoder under data-tolkningen skede, detta kan också avslöja så mycket kritisk information som perusing en fagocytos Time-lapse video.
Protocol
Representative Results
Discussion
I papperet, olika tekniker har framgångsrikt använts för att avslöja det möjliga resultatet som kan uppstå när amoeba interagera med kryptokockmeningit celler. Dessutom var vi intresserade av att Visa effekterna av 3-hydroxy fettsyror på resultatet av Cryptococcus-amoeba interaktioner.
Den första tekniken som användes var konfokal mikroskopi, som gjorde stillbilder. Den stora nackdelen med denna teknik här var att det bara gav oss information som är begränsad till en viss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av ett bidrag från National Research Foundation i Sydafrika (Grant Number: UID 87903) och University of the Free State. Vi är också tacksamma för tjänster och assistans som erbjuds av Pieter Van Wyk och Hanlie Grobler under våra mikroskopi studier.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
