विशाल कोशिका Arteritis में फोलेट रिसेप्टर बीटा मैक्रोफेज और संवहनी प्रतिरक्षा Microenvironment प्रोफाइल करने के लिए एक Immunohistopathologic अध्ययन
Summary
प्रोटोकॉल histopathologic परीक्षा और प्रोफाइल करने के लिए immunohistochemistry के उपयोग को दर्शाता है फोलेट रिसेप्टर बीटा मैक्रोफेज और कुल प्रतिरक्षा सेल के साथ अपने रिश्ते को विशाल सेल arteritis में लौकिक धमनी बायोप्सी में घुसपैठ ।
Abstract
विशाल कोशिका arteritis (जीसीए) मध्यम-से-बड़े आकार की धमनियों की पुरानी प्रतिरक्षा-मध्यस्थता वाली बीमारी है जो पुराने वयस्कों को प्रभावित करती है । जीसीए गठिया और सिर दर्द, स्ट्रोक या दृष्टि हानि के पूर्णावरोधक लक्षण के साथ प्रकट होता है । मैक्रोफेज और टी सहायक लिम्फोसाइटों संवहनी दीवार घुसपैठ और एक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि पोत नुकसान और ischemia करने के लिए नेतृत्व का उत्पादन । तारीख करने के लिए, वहाँ कोई जीसीए है कि रोग गतिविधि की निगरानी और चिकित्सीय प्रतिक्रिया का मार्गदर्शन कर सकते हैं ।
फोलेट रिसेप्टर बीटा (FRB) एक glycosylphosphatidylinositol प्रोटीन है कि कोशिका झिल्ली पर लंगर डाला है और आम तौर पर myelomonocytic वंश में व्यक्त और माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं के बहुमत में के रूप में अच्छी तरह के रूप में ट्यूमर और रुमेटी श्लेष मैक्रोफेज में है, जहां इसकी अभिव्यक्ति रोग गंभीरता के साथ संबद्ध है । फोलेट यौगिकों, फोलिक एसिड-conjugates और antifolate दवाओं को बांधने के लिए FRB की क्षमता यह कैंसर और भड़काऊ रोग अनुसंधान में एक druggable लक्ष्य बना दिया है । इस रिपोर्ट में histopathologic और immunohistochemical GCAimmunopathology के संबंध में FRB के अभिव्यक्ति और वितरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन है ।
Formalin-फिक्स्ड और आयल-एंबेडेड लौकिक धमनी बायोप्सी से जीसीए और सामांय नियंत्रण Hematoxylin और Eosin ऊतक प्रोटोकॉल की समीक्षा करने के लिए और pathognomonic सुविधाओं की पहचान के साथ दाग थे । Immunohistochemistry FRB, CD68 और CD3 अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक सूक्ष्म विश्लेषण के लिए 10 चयनित उच्च शक्ति क्षेत्र वर्गों और धमनी की दीवार में उनके संबंधित स्थानों पर सकारात्मक दाग कोशिकाओं की संख्या यों तो किया गया था ।
Lymphohistiocytic (LH) intimal हाइपरप्लासिया और बाधित लोचदार लेमिना के साथ सूजन जीसीए में नियंत्रण में पाया कोई नहीं के साथ देखा गया था । LH घुसपैठ लगभग ६०% लिम्फोसाइटों और ४०% मैक्रोफेज की रचना की थी । FRB अभिव्यक्ति मैक्रोफेज तक ही सीमित था, कुल CD68 + मैक्रोफेज जनसंख्या का 31% शामिल है और मीडिया और adventitia के लिए स्थानीयकृत । कोई FRB नियंत्रण में देखा गया था ।
इस प्रोटोकॉल जीसीए में संवहनी प्रतिरक्षा microenvironment के सापेक्ष FRB मैक्रोफेज के एक विशिष्ट संख्यात्मक और स्थानिक पैटर्न का प्रदर्शन किया ।
Introduction
विशालकाय कोशिका arteritis (जीसीए) मध्यम से बड़ी धमनियों की एक भड़काऊ बीमारी है, महाधमनी और इसकी शाखाओं को लक्षित और पुराने वयस्कों को प्रभावित । यह सिर दर्द, जबड़े में दर्द, दृष्टि हानि, स्ट्रोक और ऊतक अवसाद के रूप में गंभीर कोरोनरी जटिलताओं के लिए हल्के के साथ प्रस्तुत करता है । निदान एरिथ्रोसाइट अवसादन दर (ESR) और लौकिक धमनी बायोप्सी (टैब)1पर एक अलग histopathologic पैटर्न की तरह उच्च भड़काऊ मार्करों द्वारा की पुष्टि की है । जीसीए सबसे आम वयस्क वाहिकाशोथ है, और लौकिक धमनी की पहुंच निदान के लिए प्राप्त अंय vasculopathies पर एक लाभ प्रस्तुत करता है, इस प्रकार एक को सक्षम करने के लिए अपनी रोगजनन और अधिक आसानी से अध्ययन । टैब पर ठेठ निष्कर्षों मैक्रोफेज की घुसपैठ/histiocytes और टी लिम्फोसाइटों tunica intima, मीडिया के सभी संवहनी परतों में पाया, और लोचदार adventitia है कि आम तौर पर इन अलग है के समवर्ती विनाश के साथ लेमिना शामिल कंपार्टमेंट2. वर्तमान साक्ष्य दर्शाता है कि जीसीए एक अज्ञात प्रतिजन है कि संवहनी adventitia में वृक्ष कोशिकाओं को सक्रिय करता है, सहायक टी (गु) कोशिकाओं की भर्ती के बाद, विशेष रूप से Th1 और Th17 उपप्रकार जो interleukin-17 स्रावित और इंटरफेरॉन-गामा (IFG) क्रमशः. IFG तो रंगरूटों और साइटोकिंस और मैक्रोफेज उत्पादन करने के लिए सक्रिय करता है । ये समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस शामिल हैं; IL-12 सहित, जो पारस्परिक रूप से Th1 कोशिकाओं को सक्रिय करता है इस प्रकार एक सकारात्मक प्रतिक्रिया पाश प्रदान; ट्यूमर परिगलन कारक और interleukin-6, जो कारण गठिया और बुखार और metalloproteases कि लोचदार लेमिना नुकसान । ग्लुकोकोर्तिकोइद (GC), जो मानक जीर्ण चिकित्सा का गठन, आंशिक रूप से Th17/IL-17 लेकिन Th1/IFG हाथ की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया3,4के तनु द्वारा cytokine रास्ते को नियंत्रित । दुर्भाग्य से, रोग पतन में जीसी परिणामों के विच्छेदन । एक वैकल्पिक रूपरेखा के रूप में, methotrexate जीसीए उपचार के लिए repurpose किया गया है, लेकिन वांछित नैदानिक अंतिमबिंदु लगातार प्राप्त नहीं किया गया है, हालांकि अधिक संवेदनशील उपचिह्न चिकित्सकीय निगरानी के लिए उपयोग नहीं किया गया है5,6 . २०१७ में, interleukin 6 अवरोधक, tocilizumab, जीसीए के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया था के रूप में यह प्रभावी ढंग से प्रदर्शन रोग नियंत्रण और स्टेरॉयड7,8बख्शते.
तारीख करने के लिए, वहां जीसीए के लिए कोई अच्छा नहीं कर रहे है मार्क्स । नतीजतन, प्रतिकूल प्रभावों से बचने और समाज को लागत के बोझ को कम करने के लिए रोग गतिविधि और उपलब्ध दवाओं की अनुमापन खुराकों पर नजर रखना मुश्किल होता है । इस प्रकार, यह एक उंमीदवार है कि रोग गतिविधि के साथ संबद्ध है, रोगजनन पर उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करने और चिकित्सीय निर्णयों में सहायता के लिए देखने के लिए आवश्यक है ।
मैक्रोफेज सक्रियण के dysregulation जीसीए रोगजनन में एक महत्वपूर्ण कारक है । इस प्रकार, जीसीए के इलाज का एक प्रभावी साधन सक्रिय मैक्रोफेज के चयनात्मक लक्ष्यीकरण हो सकता है । फोलेट रिसेप्टर बीटा (FRB) एक glycosyl-phosphatidylinositol ग्लाइकोप्रोटीन कि कोशिका झिल्ली पर लंगर डाला है सामांय myelomonocytic कोशिकाओं, माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं और सक्रिय मैक्रोफेज में व्यक्त की है । इसके ligand, फोलिक एसिड, अपने कम रूप में एक आवश्यक विटामिन है, जो सेलुलर डीएनए संश्लेषण, मिथाइल और मरंमत9सक्षम बनाता है । FRB अभिव्यक्ति स्व-प्रतिरक्षित रोग में प्रेरित है और कैंसरजनन के दौरान । इसकी अभिव्यक्ति रुमेटी गठिया में monocytes या समर्थक भड़काऊ M1 मैक्रोफेज की सतह के लिए प्रतिबंधित है, या ठोस अंग और माइलॉयड द्रोह में विरोधी भड़काऊ M2 मैक्रोफेज करने के लिए10,11,12 , 13. सक्रिय मैक्रोफेज के एक के रूप में अपनी क्षमता की भूमिका के अलावा, FRB एक बहु कदम प्रक्रिया है कि फोलिक एसिड, antifolates या फोलेट-संयुग्मित दवाओं के लिए सेल में रिसेप्टर बाध्यकारी के साथ शुरू होता है के माध्यम से चयनात्मक दवा परिवहन सक्षम कर सकते है सतह, आंतरिक सेल मशीनरी12,14,15,16के लिए internalization, रिहाई और वांछित दवा के अंतिम प्रसव के बाद । frb के विपरीत में कैंसर की कोशिकाओं और सक्रिय मैक्रोफेज में व्यक्त की है, frb सामांय टेम कोशिकाओं में व्यक्त करने के लिए इस प्रकार यह सुनिश्चित करना है कि frb/फोलेट की मध्यस्थता दवा वितरण के लिए सीमित है के लिए नहीं कर रहे है-सकारात्मक भड़काऊ या कैंसर की कोशिकाओं frb ।
हमारे पिछले अध्ययन में, हम पहली बार है कि FRB जीसीए मैक्रोफेज में व्यक्त की है और अपनी अभिव्यक्ति CD68 + और endothelin रिसेप्टर बीटा मैक्रोफेज, जो जीसीए रोगजनन17में योगदान के साथ संबंधित है के लिए प्रदर्शन किया । इस रिपोर्ट में, हम histopathological और immunohistochemical के लिए frb मैक्रोफेज का आकलन करते थे तरीकों का वर्णन है, और कुल लिम्फोसाइट और मैक्रोफेज मायने रखता विश्लेषण के लिए जीसीए संवहनी परिदृश्य में है FRB स्थिति में अंतर्दृष्टि लाभ ।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीसीए वयस्कों में सबसे आम वाहिकाशोथ है, और इसके रोग बानगी मिसाल टी हेल्पर लिम्फोसाइटों और सक्रिय मैक्रोफेज के एक शक्तिशाली संयोजन है कि अन्य granulomatous रोगों में भी पाया जा सकता है या vasculopathies की तरह सारकॉइडोस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम डॉ डगलस सीढ़ियों, Marianne Klinger, एन Benko, संधिवातीयशास्त्र के प्रभाग/चिकित्सा और आणविक और Histopathologic कोर प्रयोगशाला, पेन स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन, Hershey पीए के सहयोग से संभव बनाया गया था ।
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
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