葉酸受容体ベータ マクロファージと巨細胞性動脈炎で微小血管免疫環境をプロファイリングする Immunohistopathologic 研究
Summary
プロトコルは、病理組織学的検査および免疫組織化学葉酸受容体ベータ マクロファージと総免疫細胞との関係は、巨細胞性動脈炎、側頭動脈生検に潜入のプロファイルの使用方法を示します。
Abstract
巨細胞性動脈炎 (GCA) は高齢者に影響を与える慢性免疫介在する病気中型-大型サイズ動脈です。GCA マニフェスト関節炎と頭痛の閉塞症状、脳卒中または視野の損失。マクロファージと T ヘルパー リンパ球、血管壁に潜入し、血管損傷や虚血につながるプロ炎症性応答を生成します。日には、疾患活動とガイド治療反応を監視することができます GCA バイオ マーカーはありません。
葉酸受容体 β (FRB) は細胞膜に固定され、通常骨髄単球性系統および腫瘍や関節リウマチの滑膜マクロファージのように同様に骨髄性白血病細胞の大半でを表す一種のタンパク質どこその表現は疾患重症度と相関。葉酸化合物、葉酸酸抱合体、antifolate 薬をバインドする FRB の機能は、がんや炎症性疾患の研究で druggable ターゲットをしました。このレポートでは、GCAimmunopathology に関連して FRB の分布と発現を評価するために使用される病理組織学的および免疫組織化学的方法について説明します。
GCA と健常者からホルマリン固定、パラフィン包埋側頭動脈生検はティッシュの組織学を復習して特徴的機能を識別するには、ヘマトキシリンとエオシンで染色しました。免疫組織化学は、FRB、CD68、CD3 の表現を検出する使用されました。選択した高電力フィールド セクション 10 および動脈壁のそれぞれの場所に積極的にステンド グラスのセルの数を定量化する顕微解析を行った。
Lymphohistiocytic (LH) 炎症を伴う内膜肥厚と乱れた弾性板はどれもコントロールは、GCA で見られました。LH 潜入は、約 60% 40% リンパ球とマクロファージの作曲されました。FRB の式は、マクロファージ、CD68 + マクロファージの総人口の 31% を構成して、メディアと外膜にローカライズされたに制限されました。コントロールで FRB は認められなかった。
このプロトコルは、GCA の血管免疫微小環境を基準にして FRB マクロファージの明確な数値的および空間的パターンを示した。
Introduction
巨細胞性動脈炎 (GCA) は、中型-大型の動脈、大動脈とその枝を対象とし、高齢者に影響を与える炎症性疾患です。それは軽度の頭痛、顎の痛み、視力低下、脳卒中と組織の壊疽など重篤な虚血性合併症を呈する。赤血球沈降速度 (ESR) と側頭動脈生検 (タブ)1に明確な病理組織学的パターンのような高い炎症性マーカーによる診断は確定します。GCA は最も一般的な成人血管炎と診断の得られる側頭動脈のアクセシビリティ提示他の vasculopathies、従ってより容易にその病因を研究する 1 つを有効にするのにはない利点。タブ上の典型的な所見は、通常これらを分離する弾性板の破壊が同時内膜や外膜メディアのすべての血管層にわたって発見した T リンパ球とマクロファージ ・組織球の浸潤コンパートメント2。GCA は、血管の外膜に樹状細胞を活性化する未知の抗原を含む現在の証拠を示して、ヘルパーの募集が続きます T (Th) 細胞、特に Th1 と th17 細胞サブタイプ インターロイキン 17 を分泌してインターフェロン-γ (IFG) それぞれ。IFG は募集し、サイトカインおよびプロテアーゼを生産するマクロファージを活性化します。炎症性サイトカイン; が含まれますIL-12 相互従って肯定的なフィードバック ループを提供する Th1 細胞を活性化するを含む関節炎、発熱および分解酵素を引き起こす腫瘍壊死因子やインターロイキン 6、弾性板を損傷します。標準的な慢性的な治療ではありません、グルココルチコイド (GC) は、部分的に th17 細胞/IL-17 が免疫応答の3,4の Th1/IFG 腕ないを減衰させることによってサイトカイン経路を制御します。残念ながら、GC の停止結果病気再発。代替療法としてメトトレキサートは GCA 治療の用途が変更されてより敏感なバイオ マーカーが治療モニタリングの5,6 活用されていませんが、ない目的の臨床的エンドポイントは達成された一貫して.それは効果的に疾病とステロイド効果7、8をさかんに示すよう、2017 年でインターロイキン 6 ブロック、トシリツマブ、GCA の治療のため承認されました。
日には、GCA の良いバイオ マーカーがないです。その結果、疾患活動性を監視し、副作用を回避し、社会コストの負担を軽減する使用可能な薬品の投与量を滴定することは困難です。したがって、疾患活動性と相関が病態および治療方針の決定の援助に関する知見を提供する候補者のバイオ マーカーを探すことが不可欠です。
マクロファージ活性化の調節不全は、GCA の発症の重要な要因です。したがって、活性化マクロファージの選択的ターゲティング GCA の治療の効果的な手段があります。葉酸受容体 β (FRB) は糖ホスファチジルイノシトールの糖タンパク質が細胞膜に固定される通常骨髄単球性白血病細胞で表され、マクロファージを活性化します。リガンド、葉酸は細胞の DNA 合成、メチル化および修理9を有効にその減少のフォームで必須のビタミンです。自己免疫疾患で、中の発がん、FRB の式が誘導されます。その式は、単球やリウマチ性関節炎、炎症性 M1 マクロファージの表面または抗炎症 M2 マクロファージに制限されて固形臓器や骨髄性悪性疾患10、11,12,13活性化マクロファージのバイオ マーカーとして、その潜在的な役割のほか、FRB は、葉酸、antifolates またはセルで葉酸共役薬物受容体結合から始まるマルチ ステップ プロセスを介して選択的薬物輸送を有効にすることはできます。表面、内面化、リリースおよび内部の細胞機械12,14,15,16に必要な薬物の最終的に配信が続きます。対照的に FRB 癌細胞で発現し、マクロファージを活性化、正常造血細胞で発現した FRB はバインド葉酸 FRB/葉酸を介した薬物送達が FRB 陽性炎症や癌細胞に限定されることを確保することができます。
以前の研究では、FRB は、GCA マクロファージで表される初めてのデモンストレーションを行ったし、その発現相関 CD68 + とエンドセリン受容体ベータ マクロファージを GCA 病因17に貢献。本報告で述べるは、病理組織学的、免疫組織化学的方法 FRB マクロファージを評価するために使用分析総リンパ球およびマクロファージ カウントを GCA 血管風景で FRB の位置への洞察力を得るために。
Protocol
Representative Results
Discussion
GCA は、成人では、最も一般的な血管炎および病理学的特徴例証するヘルパー リンパ球の強力な組み合わせとその他の肉芽腫性疾患またはサルコイドーシスのような vasculopathies で見つけることができるもマクロファージを活性化し、肉芽腫性多発血管炎2,3。GCA、側頭動脈には中型-大型サイズ動脈の良い表現が用意されていて、TA 生検診断新興国の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はアン ・ アルバムのリウマチ部門医学と分子と病理コア研究所、ペンシルベニア州立大学医科大学、ペンシルバニア州ハーシー、マリアンヌ クリンガー博士ダグラス階段からの支援によって可能になった
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
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