כאן אנו מציגים בגישה רצף עמוק המספקת של קביעה לא משוחדת של nascent-3′ טרמיני, כמו גם פרופילים mutational של מולקולות דנ א חד גדילי. היישום העיקרי הוא אפיון nascent retroviral משלימים DNAs (cDNAs), intermediates שנוצר במהלך התהליך של retroviral שעתוק במהופך.
ניטור של חומצת גרעין intermediates במהלך שכפול הוירוס מספק תובנות לגבי ההשפעות של מנגנוני הפעולה של תרכובות אנטי ויראליים וחלבונים התא המארח לסינתזת DNA נגיפי. כאן אנחנו כתובת חוסר assay מבוססת תא, גבוהה-סיקור ו ברזולוציה גבוהה המסוגלת הגדרת intermediates retroviral שעתוק במהופך בתוך ההקשר פיזיולוגיים להידבקות בווירוס. השיטה המתוארת לוכדת את 3′-טרמיני (termini) של מולקולות DNA (cDNA) משלימים המתהווה בתוך תאים נגועים ב- HIV-1 ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד. הפרוטוקול כרוך קציר של התא כולו ה-DNA, העשרת יישוב של ה-DNA נגיפי באמצעות לכידת היברידית, מתאם מצדו, גודל fractionation על ידי ג’ל לטיהור, PCR הגברה, רצף עמוק, ניתוח נתונים. צעד המפתח הוא מצדו רציונלית ובלתי יעיל של מולקולות מתאם לפתוח 3′-DNA טרמיני (termini). היישום של השיטה המתוארת קובע את השפע של הפרוטוקולים הפוכה של כל אורך מסוים במדגם נתון. הוא גם מספק מידע על וריאציית רצף (פנימי) תעתיקים הפוכה, ובכך יש מוטציות פוטנציאליים. באופן כללי, וזמינותו מתאים שאלות הנוגעות דנ א 3′-סיומת, ובלבד הרצף תבנית ידועה.
על מנת לנתח ולהבין שכפול ויראלי לחלוטין, יותר ויותר מעודן טכניקות ללכוד שכפול intermediates נדרשים. בפרט, ההגדרה המדויקת של מינים חומצת גרעין ויראלי בתוך ההקשר של תאים נגועים יכולה לספק תובנות חדשות, שכן מנגנוני שכפול ויראלי רבים יש לתאריך כבר בדק בתגובות מבודד במבחנה . דוגמה הוא התהליך של שעתוק במהופך בתוך רטרווירוסים, כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) 1. השלבים השונים של שעתוק במהופך HIV-1, במהלכו רוורס טרנסקריפטאז אנזים ויראלי (RT) מעתיק הגנום RNA חד-גדילי לתוך שני גדילי ה-DNA, היו למד בעיקר בתחום מבחני הארכת תחל עם חלבונים מטוהרים ולא nucleic חומצות1,2,3,4,5. בעוד עקרונות היסוד הוקמו, מבחני כזה לא לשלב את כל הרכיבים ויראלי וסלולריות, אינן משקפות בהכרח רלוונטי מבחינה ביולוגית stoichiometries של גורמים המעורבים. לכן, עיצבנו טכניקה חזקה כדי לקבוע את הספקטרום של שעתוק במהופך intermediates עם cDNA מדויק 3′-termini (קרי, קביעת אורך המדויק שלהם) נוקלאוטיד רצפים בהקשר של זיהומים של החיים שלהם תאים6. אוסף של נתונים בזמן הקורס ניסויים יכול להיות מנוצל כדי להשוות את הפרופיל של הפרוטוקולים תחת תנאים שונים, כגון הנוכחות של מולקולות אנטי ויראליים או חלבונים, עשוי להשפיע את היעילות ואת processivity לסינתזת DNA ו הצטברות. דבר זה מאפשר הבנה מפורטת יותר של מחזור החיים של פתוגן טבעי, אשר לעיתים קרובות בסיס עיצוב שיגור תרופות, התערבות טיפולית מוצלחת.
שעתוק במהופך HIV-1 כוללת סדרה של אירועים רצופים שיזם חישול של פריימר tRNA לתבנית RNA הגנומי, אשר לאחר מכן מורחב על ידי RT לייצר תעתיק קצר cDNA חד גדילי שנקרא חיסור-strand חזק-עצירה (-sss) (ראה איור 1). לאחר מכן, cDNA – בועז מועבר מטרמינל 5′ באורך חוזר (משמאל לימין) 3′-LTR של RNA הגנומי, איפה זה anneals ואני מגישה למתחילים המשך RT המתווך התארכות של המינוס לנטישה דנ א (ראה את הדעת על שעתוק במהופך1 , 2 , 3 , 4). זו העברה סטרנד הראשון הוא אחד הצעדים הגבלת קצב של שעתוק במהופך; לפיכך, cDNA – בועז ידוע לצבור. העיצוב הבסיסי של זרימת וספריית כדי ללכוד את המוצרים שעתוק במהופך תאים נגועים המותווה איור2 א. תחל ספציפי וניתוח הגדרות אשר נמצאים בשימוש בפרוטוקול ולרשום טבלה 1 . המטרה כל מוקדם הפוך שעתוק intermediates cDNA בטווח באורך של 23 ל 650 ~ nt, הכולל את 180-182 nt – בועז הדנ א. עם זאת, עיבודים קלים המתאים את האסטרטגיה יאפשר ליישום לא רק מוצרים שעתוק במהופך מאוחר אבל גם וירוסים אחרים ומערכות, שבו המטרה היא לזהות את הקצוות DNA המכיל 3′-הו. מגבלות חשוב לשקול לכלול את טווח אורך של המוצר הסופי PCR הספריה; בפרט, תבניות שבו המרחק בין את המתאם-פתוח 3′-הסופית באתר upstream פריימר לחרוג nt ~ 1000 סביר היה פחות ביעילות לסדרם, פוטנציאל היכרות עם מטעה הטיות טכני במהלך ספריית הכנה ( ראה דיון לקבלת פרטים נוספים והצעות הסתגלות).
בעבר דווח על טכניקות מצפני שיטתי 3′-טרמיני (termini) של חומצת גרעין קווצות התמקדו RNA DNA, מולקולות. דוגמה אחת היא 3′ המירוץ (מהירה הגברה קצות cDNA)7, אשר נשענת על פוליאדנילציה של mRNA. בנוסף, מתאם מבוססי מצדו אסטרטגיות העסקת RNA ligases פותחו, אשר כללו RLM-מרוץ (RNA בתיווך ליגאז גזע)8 או תחרה (הגברה מבוססת מצדו של הקצוות cDNA)9. חשוב להדגיש כי amplifications מבוססי מצדו רגישים לכל הטיה שהציג את התגובה מצדו עצמו. לדוגמה, מצדו עשוי להיות יעיל יותר או פחות בהתאם נוקלאוטיד מסוים המיקום 3′, רצף, מולקולה סה כ אורך, או מבנה מקומי. העדפות ליגאז כזה להוביל לכידת לא שלם של מולקולות, סילוף של המדידה, אשר אנחנו ואחרים הבחינו9,10. כדי לצמצם הטיה מצדו במהלך השלבים בנוסף מתאם בפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, אנחנו מספר אסטרטגיות מצדו נבדק ונמצא את השימוש T4 DNA ליגאז עם מתאם דנ א חד גדילי סיכת ראש (כפי שתואר על ידי קווק et al. 11) להיות ההליך היחיד עם יד מצדו כמותית זה לא לגרום הבדלים משמעותיים מצדו יעילות כאשר העריך עם קבוצת הבקרה oligonucleotides6שנבחרו במיוחד. הבחירה של אסטרטגיה זו מצדו הוא, לכן, תכונה מפתח להצלחת פרוטוקול זה.
עד כה, ניטור של התקדמות RT HIV-1 תאים נגועים בעיקר, הושג על ידי מדידת מוצרים שעתוק במהופך של אורך שונים עם ה-PCR כמותי (qPCR) באמצעות ערכות פריימר-בדיקה המודדים באופן ייחודי ארוכה או קצרה יותר (בראשית ו מאוחר, בהתאמה) cDNA מוצרים12,13,14. בעוד גישה qPCR זו הוא המתאים לקביעת היעילות מהותי מתהליך שעתוק במהופך בתוך מערכות סלולריות, הפלט הוא של רזולוציה נמוכה יחסית, ללא מידע רצף להיות נגזר. הגישה החדשה שלנו, בהתבסס על מתאם ממוטבת מצדו, ספריית בתיווך PCR הדור, רצף עמוק כתובות הפער טכנולוגיה, מציע הזדמנות לעקוב אחר שעתוק במהופך במהלך זיהום ב- HIV-1 באופן כמותי, נוקלאוטיד יחיד רזולוציה.
לנו יש מאויר השירות של שיטה זו במחקר זה להבחין בין שני מודלים מוצעים עבור הקיבולת של הגורם הגבלת HIV-1 APOBEC3G (אפוליפופרוטאין B mRNA העריכה אנזים קטליטי מפוליפפטיד כמו דור 3) להתערב עם הפקה של נגיפי תעתיקים הפוכה6.
הזמינות של רצף עמוק מהירה, אמינה וחסכונית יש מהפכה היבטים רבים בתחום מדעי החיים, המאפשר עומק רב ניתוחים המבוססת על רצף. אתגר הנותרים טמון חדשני לעיצוב ויצירה של נציג רצף ספריות. כאן נתאר פרוטוקול כדי ללכוד nascent ויראלי cDNA מולקולות, במיוחד intermediates של תהליך שעתוק במהופך HIV-1.
השלב הקריטי ביותר באסטרטגיה זו הוא מצדו של מתאם ל פתוח 3′-טרמיני באופן כמותי לא משוחדת. היעילות של ligations בין שני ssDNA טרמיני (termini), שניהם אינטר- ואת התפלגות, חקר, אופטימיזציה עבור מגוון יישומים11,26,27,28,29. הבחירה של באמצעות מתאם סיכת ראש עם T4 DNA ליגאז בתנאים המתוארים שלב 3.3 הוא התוצאה של אופטימיזציה אמפירי שבו אנו מוערכים ligases שונים, מתאמים, ריאגנטים עבור מצדו של oligonucleotides סינתטיים המייצגים רצפים HIV-1 (טבלה 2) (נתונים לא מוצג). בתגובות מבחן אלה במבחנה , אישרנו T4 DNA ליגאז מתווכת מצדו של מתאם סיכת ראש, כפי שתואר על ידי קווק ואח. 11, יש דעה קדומה נמוכה מאוד, והוא משיג ליד מוחלטת מצדו של מולקולות מקבל כאשר המתאם משמש עודף. היעילות מצדו לא הושפע התוספת של נוקלאוטיד ברצף כדי להבהיר את המתאם תואם למערכת פריימר מולטיפלקס (ראה איור 4). לשם השוואה, מצאנו כי thermostable 5′ DNA/RNA ליגאז (ראה “ליגאז A”, בטבלה של חומרים עבור המדויק ligases בהשוואה כאן), שהינו מהונדסים RNA ליגאז שפותחה באופן חלקי כדי לשפר את יעילות מצדו עם ssDNA כמו מקבל 27, היה אכן יותר יעיל נבדק שתי מולקולות ssDNA מאשר רנ א ליגאז (ליגאז B”) אבל נאלץ דעה קדומה משמעותי, עם הבדלים חריפים יעילות מצדו אפילו בין oligonucleotides עם הבדלים אורך בסיס יחיד [בטבלה 2 ; HTP con אמצע G (א) ו- (ב)]. יתר על כן, מצאנו רק דעה קדומה מינימלי בתגובות עם “ליגאז C” בשילוב עם מתאם נושא של אקראי 5′-termini (אסטרטגיה להשתמש כדי לקזז נוקלאוטיד ידוע הטייה של “ליגאז C”; ר’ למשל דינג et al. 30). עם זאת, ליגאז C-ligations הבין-מולקולרי בתיווך לא היו שלמים, עיבוד T4 DNA ליגאז המערכת הבחירה מעולה.
מספר פעולות בקרת איכות על הקורס של הפרוטוקול והכללה של פקדים חיוביים ושליליים לאפשר איתור בעיות פוטנציאליות לפני המשך assay ולספק הדרכה לפתרון מאמצים. Quantifications qPCR בשלבים 2.2.2 ו 2.3.12 להבטיח כי כמות החומר קלט מספיקה. CDNA טיפוסי עותק המספרים בטווח • תנאי (מתוך שלב 2.1) 200 µL מ בסביבות 10,000 ל 300 אלף µL. הצעד לכידת היברידית יכול לגרום לאובדן של HIV-1 הכוללת חלק cDNA כמות אך צריך לגרום לכך העשרת חזקה של cDNA HIV-1 ספציפית על הסלולר הדנ א, אשר יכול להיקבע על-ידי שימוש תחל המתאים כדי לכמת את הדנ א לפני ואחרי העשרה על-ידי qPCR או על ידי מדידת ריכוז ה-DNA מוחלט. התאושש cDNA HIV-1 לאחר ההיברידית ללכוד צעדים צריך להיות לפחות 10% של הקלט. נמוך החל חומר עשוי להסביר אחרת פקד חיובי oligonucleotide מוצלח (ראה שלב 3.3.2) אבל רק מוגבלת קריאות מושגת הדגימות. נמוך לקרוא מספרים הכוללת גם יכול להיות מוסבר על ידי מופרזת של הריכוז ספריית בשל נוכחותם של מינים לא רלוונטי DNA ללא מתאמים MiSeq. זה יגרום בצפיפות נמוכה אשכול, ניתן לשפר באמצעות קביעת הריכוז של HIV-1 רצפים בספרייה מאת qPCR בנוסף הסכום הכולל של ה-DNA על ידי מבחני fluorometric. בשל אופיו רגישה מאוד של השיטה, טיפול מיוחד יש לנקוט כדי למנוע זיהום אפילו ברמה נמוכה, שניהם מדגימות אחרים (בפרט, מתוך המניות שליטה ריכוז גבוה oligonucleotide) כמו גם כמו של ציוד מעבדה. עובד באולטרה לחיטוי PCR תחנת העבודה הוא מועיל בהקשר זה. בג’ל אוטומטיות של הספרייה הסופי (שלב 6.1.2) הוא מדד בקרת איכות נוספים. הטווח גודל חומצת גרעין בדרך כלל שנצפה הוא בין 150-500 nt. תחל שניתן לאתר בפקד אופציונלי לאחר את ה-PCR, ולפני טיהור (ראה הערה בשלב 5.2) אמור הנעדר. תוצאה נציג, עקומת העוצמה המדגם כולל לשיא בסביבות 160 170 nt וחד יותר השני של שיא בסביבות 320 ל 350 nt. זה משקף ככל הנראה לעתים קרובות-ראה שפע גבוה יותר קצר יחסית תעתיקים הפוכה (1-20 nt הוספה אורך) והן באורך מלא חזק הפסקה (180 עד 182 nt הוספה אורך) (איור 3ב’).
בעוד הפרוטוקול הציג לבין תחל שנבחרו הן ספציפיות עבור בונה מוקדם של שעתוק במהופך HIV-1, השיטה זו חלים באופן כללי על כל מחקר במטרה לקבוע פתוח 3′-טרמיני (termini) של ה-DNA. השינויים העיקריים הנדרשים בהקשרים אחרים תהיה השיטה עבור לכידת היברידית ואסטרטגיה עיצוב של פריימר. לדוגמה, אם המטרה היא להיות מותאם מאוחר תעתיקים HIV-1, מספר גדול יותר של שונים oligonucleotides biotinylated לכידת חישול על פני אורך cDNA יהיה מומלץ, יקטן ככל הנראה את ההפסד בשלב לכידת היברידית. כאמור במבוא, חשוב לקחת בחשבון את מגבלות בעת עיצוב הטווח שבו 3′-termini הם יזוהו להימנע מקורות שונים של הטיה. ראשית, ייתכן דעה קדומה תגובות PCR אם התבניות עם מתאם אורך משתנה במידה רבה. שנית, רצף פלטפורמת המשמש כאן (למשל, MiSeq) יש טווח אורך הוספה המועדפת עבור קיבוץ באשכולות אופטימלית, ולא באופן משמעותי מוצרים קצר וארוך עשוי לא להיות וסודרו עם יעילות זהה. בחלקה זו ניתן לטפל שהמפתחות, כפי שנעשה על-ידי חישוב מקדם תיקון עבור אורך קדומה (ראה איור 4, הגרף התחתון). עם זאת, אם האזור שבו רצוי 3′-termini מיפוי ארוך (nt > 1000), רצוי יותר לפצל את התגובות עם התרשימים מחוברים ולהשתמש primers נגד הזרם מרובים כדי להעריך 3′-termini בסעיפים.
התוכנית ניתוח נכתב בתוך הבית עבור מטרה ספציפית של ניתוח שני נוקלאוטיד האחרון את רצף HIV-1 סמוכים רצף מתאם קבוע, כמו גם את הווריאציה הבסיס של כל בסיסים לזהות מוטציות כל. השלבים הבודדים המרכיבים הבאים: ראשית, רצפי מתאם נסגרים באמצעות ערכת הכלים fastx-0.0.13; לאחר מכן, יוסרו כל רצפי אשר משוכפלות (כלומר רצפים זהים כולל הברקוד). כל קורא ייחודי הנותרים מיושרים ואז הרצף HIV-1 באמצעות עניבת הפרפר (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) עם ההתאמה המרבית שוכן בגובה שלושה בסיסים. הרצף תבנית מורכבת של 635 הראשון nt של HIV-1 cDNA (זן NL4.3), הכוללת את הרצף – בועז, המוצר הראשון של העברת סטרנד עד המסלול polypurine (U5-R-U3-PPT; ראה איור 1). ובכך, התוכנה שסופקה ואת תבניות מתאימים רק ישירות אם השיטה משמשת אותו יישום (זיהוי מוקדם הפוכה תעתיקים של HIV-1NL4.3). התאמות תצטרך להתבצע עבור רצפי יעד אחרים. העמדות של 3′-טרמיני עבור כל קריאה נקבעו על ידי העמדה היישור. השיחות הבסיס לכל תפקיד מוקלטות, מוטציה המחירים מחושבים מתוך סה כ סיקור כל בסיס, אשר משתנה, כמו קורא באורכים שונים, מוסיף הרבה זמן אולי לא לגמרי יכוסה על ידי רצף 125-בסיס ב- Read2.
לסיכום, אנו מאמינים השיטה המתוארת כדי להיות כלי רב ערך עבור סוגים רבים של מחקרים. ברור יישומים כוללים חקירות של המנגנונים עיכוב שעתוק במהופך דרך תרופות תרופתי או הגבלת הסלולר גורמים. אולם, התאמות קלות יחסית צריך שיהיה צורך להתאים את המערכת כדי 3′-termini מיפוי בתוך אחרים חד גדילי DNA נגיפי intermediates, אשר נמצאים, לדוגמה, בשכפול הפרוו. יתר על כן, העיקרון של השיטה, במיוחד שלה צעד מצדו ממוטבת, באפשרותך לספק חלק הליבה של הספרייה הכנה עיצוב עבור אפיון כל הרחבות 3′-DNA, כולל elongations על ידי תאי DNA גדילי כפול polymerases.
The authors have nothing to disclose.
המחברים להכיר את התמיכה של חברי של מלים מעבדה, לואיס אפולוניה, אולה Jernej, רבקה אוקי. המחברים תודה מאט ארנו במרכז של המלך קולג בלונדון גנומית, דבי יוז ב לונדון מכללת אוניברסיטת (UCL), מנהלת המכון לנוירולוגיה הבא הדור רצף מתקן, על העזרה עם רצף MiSeq. העבודה נתמך על ידי בריטניה הרפואי המועצה למחקר (G1000196 ומר/M001199/1 כדי מ’מ), טרסט (106223/ת/14/Z כדי מ’מ), תכנית המסגרת השביעית של הנציבות האירופית (האיחוד FP7/2007-2013) בהסכם גרנט לא. PIIF-GA-2012-329679 (כדי D.P.), ועל את משרד הבריאות באמצעות המכונים הלאומיים פרס הבריאות מחקר מקיף ביו-רפואית מרכז מחקר לקרן NHS של האיש, סנט תומס אמון בשותפות בקינגס קולג ‘-לונדון, המלך מכללת בית החולים NHS קרן נאמנות.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco | 31966-021 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15150-122 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
HeraCell Vios 250i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030966 | |
Laminar flow hood – CAS BioMAT2 | Wolflabs | CAS001-C2R-1800 | |
10mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
TrypLE™ Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme | Gibco | 12605-010 | |
OptiMEM® (Minimal Essential Medium) | Gibco | 31985-047 | |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | NIH Aids reagent program | 114 | |
Polyethylenimine (PEI) – MW:25000 | PolySciences Inc | 23966-2 | dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7 |
RQ1- Rnase free Dnase | Promega | M6101 | |
Filter 0.22 μm | Triple Red Limited | FPE404025 | |
15 mL polypropylene tubes | Corning | CLS430791 | |
Sucrose | Calbiochem | 573113 | |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-094 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | |
Ultracentrifuge | Sorval | WX Ultra Series | Th-641 Rotor |
Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit | Perkin Elmer | NEK050001KT | |
CEM-SS cells | NIH Aids reagent program | 776 | |
Roswell Park Memorial Institute Medium | Gibco | 31870-025 | |
CoStar® TC treated multiple well plates | Corning | CLS3513-50EA | |
Benchtop centrifuge: Heraus™ Multifuge™ X3 FR | Thermo Scientific | 75004536 | |
TX-1000 Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003017 | |
Microcentrifuge: 5424R | Eppendorf | 5404000060 | |
Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit) | Qiagen | 69504 | |
Nuclease free H2O | Ambion | AM9937 | |
Cutsmart buffer | New England Biolabs (part of DpnI enzyme) | R0176S | |
DpnI restriction enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
Oligonucleotides for qPCR | MWG Eurofins | N/A | HPSF purification |
TaqMan PCR Universal Mastermix | Thermo | 4304437 | |
LoBind Eppendorf® tubes | Eppendorf | 30108078 | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 1000 μL | Fisher Scientific | TF-000-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 200 μL | Fisher Scientific | TF-200-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 20 μL | Fisher Scientific | TF-20-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 10 μL | Fisher Scientific | TF-10-R-S | |
PCR clean hood | LabCaire | Model PCR-62 | |
DynaMag™2-magnet | Thermo | 12321D | |
Streptavidin MagneSphere® paramagnetic particles | Promega | Z5481 | |
Casein | Thermo Scientific | 37582 | |
End over end rotator, Revolver™ 360° | Labnet | H5600 | |
Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Hydrochloric Acid | Sigma | H1758-100ML | |
EDTA disodium salt dihydrate | Electran (VWR) | 443885J | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Dri-Block® Analog Block Heater | Techne | UY-36620-13 | |
PCR tubes and domed caps | Thermo Scientific | AB0266 | |
PCR machine | Eppendorf | Mastercycler® series | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202M | |
40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000 | Sigma | P1458-25ML | |
Betaine solution, 5M | Sigma | B0300-1VL | |
Gel loading buffer II (formamide buffer) | Thermo Scientific | AM8546G | |
Precast 6% TBE urea gels | Invitrogen | EC6865BOX | |
Mini cell electrophoresis system | Invitrogen, Novex | XCell SureLock™ | |
Tris/Borate/EDTA solution (10x) | Fisher Scientific | 10031223 | |
Needle 21 G x1 1/2 | VWR | 613-2022 | |
SYBR Gold nucleic acid stain (10000x) | Life Technologies | S11494 | |
Dark Reader DR46B transilluminator | Fisher Scientific | NC9800797 | |
Ammonium acetate | Merck | 101116 | |
SDS solution 20% (w/v) | Biorad | 161-0418 | |
Centrifuge tube filter | Appleton Woods | BC591 | |
Filter Glass Fibre Gf/D 10mm | Whatman (VWR) | 512-0427 | |
polyadenylic acid (polyA) RNA | Sigma | 10108626001 | |
Glycogen, molecular biology grade | Thermo Scientific | R0561 | |
Isopropanol (2-propanol) | Fisher Scientific | 15809665 | |
Ethanol, molecular biology grade | Fisher Scientific | 10041814 | |
Accuprime™ Supermix I (DNA polymerase premix) | Life Technologies | 12342-010 | |
NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2) | New England Biolabs | E7335S; E7500S | |
Tapestation D1000 Screentape High sensitivity | Agilent Technologies | 5067- 5584 | |
Tapestation D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067- 5585 | |
2200 Tapestation – automated gel electrophoresis system | Agilent Technologies | G2965AA | |
Agencourt® AMPure® beads XP | Beckman Coulter | A63880 | |
Qubit™ dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
Qubit™ 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Topo™ TA cloning Kit | Invitrogen | 450071 | |
Sequencing platform: MiSeq System | Illumina | ||
Experiment Manager (Sample sheet software) | Illumina | Note: Use TruSeq LT as a template | |
Miseq™ Reagent kit V3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Sequencing hub: Basespace | Illumina | https://basespace.illumina.com | |
Ligase A: Thermostable 5’ App DNA/RNA ligase | NEB | M0319S | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase B: T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase C: CircLigase | Epicentre | CL4111K | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |