Dans ce protocole, nous décrivons le flux de travail complet pour isolation rapide des vésicules extracellulaires du sang humain et de la caractérisation des marqueurs spécifiques par analyse de suivi des nanoparticules axée sur la fluorescence. Les résultats présentés montrent une reproductibilité élevée et peuvent être ajustées pour les surnageants de culture cellulaire.
Les vésicules extracellulaires (EVs), y compris les exosomes, sont spécialisées vésicules taille nanométrique membraneuses dans les fluides corporels sont constitutivement libérés de nombreux types de cellules qui jouent un rôle essentiel dans la régulation des communication de cellule-cellule et un large éventail de processus biologiques. Différentes méthodes de caractérisation des EVs ont été décrits. Cependant, la plupart de ces méthodes ont l’inconvénient que la préparation et la caractérisation des échantillons sont très coûteuses en temps, ou il est extrêmement difficile d’analyser des marqueurs spécifiques d’intérêt en raison de leur petite taille et en raison du manque de discrets populations. Alors que les méthodes d’analyse des EVs ont été considérablement améliorées ces dix dernières années, il n’y a encore aucune méthode normalisée pour la caractérisation de l’unique EVs. Ici, nous démontrons une méthode semi-automatique pour la caractérisation des EVs unique par analyse de suivi des nanoparticules axée sur la fluorescence. Le protocole présenté aborde le problème commun de nombreux chercheurs dans ce domaine et fournit le flux de travail complet pour isolation rapide des EVs et caractérisation avec PKH67, un linker de la membrane de la cellule générales, ainsi qu’avec des marqueurs de surface tels CD63, CD9, vimentine et protéine de la membrane lysosomale associés à 1 (lampe-1). Les résultats présentés montrent un haut niveau de reproductibilité, tel que confirmé par d’autres méthodes, telles que Western Blot. Dans les expériences menées, nous avons utilisé exclusivement EVs isolées d’échantillons de sérum humain, mais cette méthode est également adaptée pour le plasma ou d’autres liquides organiques et peut être ajustée pour la caractérisation des EVs de surnageants de culture de cellules. Quel que soit l’évolution future de la recherche sur la biologie de l’EV, le protocole qui est présenté ici fournit une méthode rapide et fiable pour la caractérisation rapide des EVs unique avec des marqueurs spécifiques.
Les vésicules extracellulaires (EVs), y compris les exosomes, sont spécialisées vésicules de taille nanométrique membraneux (20-150 nm) contenant certaines combinaisons de lipides, adhérence et molécules de signalisation intercellulaires, ainsi que d’autres composants fonctionnels cytosoliques comme microARN (miARN) et ARNm et jouer un rôle essentiel dans la régulation de cellule-cellule communication1,2. SVE est libérés dans leur environnement de nombreux différents types de cellules, par exemple, les cellules endothéliales, les cellules immunitaires et les cellules tumorales et peut être détectées dans les liquides organiques comme le sperme de sérum, urine, le lait maternel, salive ou le liquide céphalorachidien3, 4. nombre croissant d’études en évidence la contribution diversifiée des véhicules électriques comme biomarqueurs potentiels pour un diagnostic précoce de plusieurs maladies et/ou de prédiction de la progression de la maladie5,6. Exosomes sont souvent décrits par la présence de molécules qu’elles sont spécifiquement associées, quel que soit le type de cellule, qu’ils dérivent de7. Par exemple, les exosomes contiennent différents tetraspanins (CD9, CD63, CD81), grandes classe complexe d’histocompatibilité j’ai (MHC I) molécules, diverses protéines transmembranaires, protéines cytosoliques typique (tubuline et l’actine), des molécules impliquées dans les corps multivésiculaires ( Biogenèse MVB) (TSG101 et alix), chauffer des protéines de choc (HSP 70 et HSP 90), et les protéines qui participent au signalent transduction (protéines kinases)8.
Différentes méthodes ont été décrites pour la caractérisation des EVs9. Les méthodes plus courantes et les plus répandues pour l’analyse de l’EV sont écoulement cytometry10, microscopie à balayage électronique (SEM) et transmission electron microscopy (TEM)11. La méthode première et couramment utilisée pour la caractérisation biochimique de la teneur en EV est Western blotting12,13. Tandis que les SEM et TEM permettent la détection des véhicules électriques dans tout l’éventail de toute taille, l’identification très limitée des protéines de surface spécifiques est un désavantage particulier de ces méthodes. En revanche, cytométrie en flux est un outil puissant pour l’identification de marqueurs de surface spécifiques EV, mais le seuil de cette méthode limite l’analyse au SVE, d’une taille supérieure à 500 nm. Par conséquent, analyse des véhicules électriques isolés avec la détection de marqueurs de surface spécifiques n’est actuellement pas accessible par le biais de ces trois méthodes bien établies. Nous avons décrit précédemment une autre méthode très sensible pour la visualisation et l’analyse du SVE, suivi des nanoparticules analyse (NTA)14. En bref, cette méthode combine deux principes physiques différents. Tout d’abord, particules éparpiller lumière lorsqu’ils sont irradiés par un faisceau laser, et le second principe, appelé mouvement brownien, implique que la diffusion de différentes particules dans une suspension liquide est inversement proportionnelle à leur taille. L’instrument d’analyse semi-automatique nanoparticule bureau pour les échantillons liquides se compose de la particule suivi analyseur avec une analyse informatisée, où sont enregistrées les images numériques de la lumière diffusée de particules unique. Les particules et le mouvement des particules sont détectés par un microscope laser de diffusion avec une caméra vidéo. Le faisceau laser est orienté verticalement, tandis que l’axe optique est horizontal et ciblée dans le canal de cellule rempli avec l’échantillon. Les données fournies par les parcelles de lumière des taches éparses et leur vitesse de déplacement permettent la détermination de la distribution de comte et de la taille des particules totales. Après irradiation par le laser, les particules diffusent la lumière, qui est enregistré par une caméra vidéo numérique via le microscope14. L’avancement de notre première méthode est l’insertion d’un filtre de coupure longue vague-pass (LWP) à 500 nm entre le laser (longueur d’onde de 488 nm) et le canal de la cellule, qui permet l’analyse directe des particules marqués par fluorescence (Figure 1). Notre protocole traite la demande commune de nombreux chercheurs dans ce domaine pour une caractérisation rapide des EVs unique, par exemple, selon leur origine parentale. Dans ce protocole, nous décrivons le flux de travail complet pour isolation rapide des véhicules électriques du sang humain et de la caractérisation rapide des marqueurs spécifiques par analyse de nanoparticules de suivi axée sur la fluorescence. Serveur virtuel Exchange peut être détectée par coloration avec PKH67, un linker de la membrane de la cellule générales, ainsi qu’avec des marqueurs spécifiques d’exosomal, par exemple, CD63, CD9 et vimentine. Notre protocole est également adapté aux EDTA et plasma citraté, ainsi qu’autres fluides corporels et les surnageants de culture de cellules.
Nous démontrons un protocole détaillé pour l’isolation des véhicules électriques du sang total et de la caractérisation rapide des marqueurs de surface spécifiques avec des nanoparticules basés sur la fluorescence analyse de suivi. Dans les expériences menées, nous avons utilisé exclusivement EVs isolées d’échantillons de sérum, mais cette méthode est également adaptée pour l’acide tétraacétique (EDTA) et plasma citraté et peut également être étendue à d’autres liquides corporels tels que le lait maternel, l’urine, la salive, le liquide céphalorachidien et le sperme. En outre, le présent protocole peut être ajusté pour la caractérisation des EVs de surnageants de culture de cellules. Dans ce protocole, la suspension de l’EV a été générée à partir de 100 μL de sérum, utilisant un réactif de précipitation exosome, qui contient un polymère qui précipite doucement les exosomes et EVs selon une taille corpusculaire allant de 30 nm à 200 nm, auquel cas 10-20 μL des véhicules électriques ont été nommés pour la caractérisation de chaque marqueur de surface. Malheureusement, l’étape d’isolement est inévitable, car la quantité élevée de protéines dans le sérum (p. ex., albumine et globuline) interfère avec l’anticorps procédure de coloration et aboutit à haut niveau de fond et résultats sophistiqués. En outre, selon la disponibilité biologique de l’exosomes dans les échantillons, le montant de la suspension de EV indépendant ainsi que la dilution avant traitement doit être ajusté pour d’autres matériaux de source. Pour comparer des échantillons multiples, il faut une approche normalisée pour la dilution de l’échantillons, mais aussi les paramètres d’acquisition cohérent (sensibilité, obturateur, etc.). Un autre point important est que les mesures ne sont pas démarrés, jusqu’à ce que la dérive est faible (entre nos mains, < 5 μm/s). Si la dérive était trop élevée, des mesures répétées de l’échantillon donné grande écart entre eux, mais avec une faible dérive, les données résultantes étaient très compatibles et confirment un niveau élevé de reproductibilité. Il est important que les anticorps sélectionnés ont un fluorochrome approprié. Anticorps doivent être conjugués avec Alexa Fluor 488, FITC ayant un taux élevé de blanchiment photo. Éventuellement fluophores plus stable conduira certainement à la stabilité accrue de dosage à l’avenir. Normalement, de nombreux chercheurs utilisent des PBS comme diluant pour EVs. Pour ce protocole, il est crucial d’utiliser l’eau distillée comme diluant pour les suspensions de EV. Quand EVs sont étiquetés avec les colorants fluorescents et l’osmolalité élevée, concentration de l’ion d’autres diluants, tels que PBS, peuvent interférer avec la mesure et plomb à modifié les résultats.
Alors que les méthodes d’analyse des EVs ont été considérablement améliorées ces dix dernières années, il n’y a encore aucune méthode normalisée pour l’isolement et la caractérisation de l’EVs. L’inconvénient majeur de cytométrie en flux, où EVs sont souvent liés à perles pour fournir une surface plus grande, est que de nombreux EVs dock à la surface pour donner un signal fort et détectable10. SEM et TEM ont l’inconvénient que la préparation des échantillons est chronophage et EVs se distingués seulement par leur taille et la morphologie11. Jusqu’à ce jour, la méthode fort et couramment utilisée pour qualitative (p. ex., biochimiques) caractérisation EV est Western blotting, où les protéines peuvent être analysées avec des anticorps spécifiques12,13. Toutefois, les inconvénients de toutes ces méthodes se trouvent dans l’incapacité d’analyser des EVs unique pour les marqueurs de surface spécifiques. En outre, les longs délais de traitement et les procédures de lavage/isolement prolongé utilisés par de nombreux protocoles actuels impliquent des étapes fastidieuses, ce qui les rend impropre pour un débit élevé échantillon et caractérisation de l’unique EVs. Notre protocole prévoit un workflow complet rapide isolement et caractérisation des EVs unique avec des marqueurs de surface spécifiques comme CD63, CD9, vimentine et CD107a et peut être étendu pour un large éventail d’autres marqueurs de surface pour déterminer l’origine de publié EVs. En raison d’un progrès technique permanent du dispositif NTA, nous avons confirmé nos résultats en coopération avec le fabricant de l’analyseur plus récent. Quel que soit l’évolution future de la recherche sur la biologie de EV, concernant en particulier les exosomes, le protocole qui est présenté ici fournira une méthode rapide et fiable pour la caractérisation des EVs unique avec des marqueurs spécifiques. Agrégation des véhicules électriques au cours de l’isolement et la procédure de marquage étant jusqu’à présent inévitable, recherche future devrait se concentrer sur le développement de méthodes pour empêcher l’agrégation EV et permettre une détermination de la taille exacte de fluorescent-étiquetées EVs.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient les particules Metrix GmbH pour couvrir partiellement les coûts de publication de cet ouvrage.
Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |