I detta protokoll beskriver vi komplett arbetsflöde för snabb isolering av extracellulära blåsor från humant helblod och karakterisering av specifika markörer genom fluorescens-baserade nanopartikel-tracking-analys. De presenterade resultaten visar en hög reproducerbarhet och kan justeras till cell cellkulturer.
Extracellulära blåsor (EVs), inklusive exosomes, är specialiserade membranös nanostorlek blåsor finns i kroppsvätskor som frigörs konstitutivt från många celltyper och spela en central roll i regleringen av cell-cell kommunikation och ett varierat utbud av biologiska processer. Många olika metoder för karakterisering av EVs har beskrivits. De flesta av dessa metoder har dock nackdelen att förberedelse och karakterisering av proverna är mycket tidskrävande, eller är det extremt svårt att analysera specifika markörer av intresse på grund av sin ringa storlek och på grund av diskreta populationer. Medan metoder för analys av EVs har förbättrats avsevärt under det senaste decenniet, finns det fortfarande ingen standardiserad metod för karakterisering av enda EVs. Här visar vi en halvautomatisk metod för karakterisering av enda EVs genom fluorescens-baserade nanopartikel-tracking-analys. Protokollet som presenteras korrigerar vanliga problem av många forskare inom detta område och ger den komplett arbetsflöden för snabb isolering av EVs och karakterisering med PKH67, en allmän cellmembranet länkare, samt med specifika yta markörer sådana som CD63, CD9, vimentin och lysosomala-associerade membranprotein 1 (lampa-1). De presenterade resultaten visar en hög reproducerbarhet, som bekräftas av andra metoder, såsom Western blotting. I de genomförda experiment, vi används uteslutande EVs isolerade från humant serumprover, men denna metod är också lämplig för plasma eller andra kroppsvätskor och kan justeras för karakterisering av EVs från cell cellkulturer. Oavsett framtida utveckling av forskning om EV biologi ger det protokoll som presenteras här en snabb och tillförlitlig metod för snabb karaktärisering av enda EVs specifika markörer.
Extracellulära blåsor (EVs), inklusive exosomes, är specialiserade membranös nanostorlek blåsor (20-150 nm) som innehåller vissa kombinationer av lipider, vidhäftning och intercellulära signalmolekyler, samt andra funktionella cytosoliska komponenter som mikroRNA (miRNA) och mRNA och spela en central roll i regleringen av cell-cell kommunikation1,2. EVs är släppt i sin omgivning från många olika celltyper, exempelvis endotelceller, immuna celler och tumörceller, och kan upptäckas i kroppsvätskor såsom serum sperma, urin, bröstmjölk, saliv eller cerebrospinalvätska3, 4. öka antalet studier belysa EVs olika bidrag som potentiella biomarkörer för tidig diagnos av flera sjukdomar eller förutsägelse av sjukdomsprogression5,6. Exosomes beskrivs ofta av närvaron av molekyler som de är särskilt förknippade med, oavsett den celltyp som de härrör från7. Till exempel exosomes innehåller olika tetraspanins (CD9, CD63, CD81), major histocompatibility complex klass jag (MHC jag) molekyler, olika transmembrana proteiner, typiska cytosoliska proteiner (tubulin och aktin), molekyler involverade i multivesicular kropp ( MVB) biogenes (TSG101 och alix), värma chockar proteiner (HSP 70 och HSP 90), och proteiner som deltar i signal transduktion (proteinkinaser)8.
Många olika metoder har beskrivits för karakterisering av EVs9. Vanligaste och mest utbredda metoderna för EV analys är flödet flödescytometri10, scanning electron microscopy (SEM) och överföring elektronmikroskopi (TEM)11. Översättningsföretag och vanligaste metoden för biokemisk karakterisering av EV innehåll är Western blotting12,13. SEM och TEM tillåta för detektion av EVs över hela storlek spektrumet, är mycket begränsad identifiering av specifika yta proteiner särskilt missgynnar dessa metoder. Däremot flödescytometri är ett kraftfullt verktyg för att identifiera specifika EV yta markörer, men tröskeln till denna metod begränsar analysen till EVs med en storlek som är större än 500 nm. Analys av isolerade EVs med påvisande av specifik yta markörer är därför för närvarande inte tillgängliga via någon av dessa tre väletablerade metoder. Vi beskrev tidigare en annan mycket känslig metod för visualisering och analys av EVs, nanopartikel-tracking analys (NTA)14. Kort, denna metod kombinerar två olika fysikaliska principer. Först, scatter partiklar ljus när de bestrålas med en laserstråle, och den andra principen, känd som Brownsk rörelse, innebär att spridningen av olika partiklar i en flytande suspension är omvänt proportionell mot deras storlek. Halvautomatisk stationära nanopartiklar analys instrumentet för flytande prov består av partikeln spårning analyzer med en mjukvaran-baserat analys, där digitala bilder av spritt ljus från enstaka partiklar registreras. Partiklarna och rörelsen av partiklarna upptäcks av en laser scattering Mikroskop med en videokamera. Laserstrålen är orienterad vertikalt, medan den optiska axeln är horisontella och fokuserad in i cellen kanal fylld med provet. Data som tillhandahålls av tomter utspridda ljusa fläckar och deras rörelsehastighet möjliggöra bestämning av total fördelning av antal och storlek. Efter bestrålning av lasern, partiklarna scatter ljuset, som är inspelad av en digital videokamera via Mikroskop14. Befordran till vår tidigare metod är införandet av en 500 nm lång våg-pass (LWP) cut-off-filter mellan laser (våglängd av 488 nm) och cell-kanalen, som möjliggör direkt analys av fluorescens-märkta partiklar (figur 1). Våra protokoll adresser gemensamma begäran av många forskare inom fältet för en snabb karakterisering av enda EVs, t.ex., enligt deras föräldrars ursprung. I detta protokoll beskriver vi den komplett arbetsflöden för snabb isolering av EVs från humant helblod och snabb karakterisering av specifika markörer genom fluorescens-baserade nanopartiklar-tracking-analys. EVs kan upptäckas genom färgning med PKH67, en allmän cellmembranet länkare, samt med specifika exosomal markörer, t.ex., CD63, CD9 och vimentin. Våra protokoll är också lämplig för EDTA och citrerade plasma, samt andra kroppsvätskor och cell cellkulturer.
Vi visar ett detaljerat protokoll för isolering av EVs från helblod och snabb karakterisering av specifik yta markörer med fluorescens-baserade nanopartiklar spårning analys. I de genomförda experiment, vi används uteslutande EVs isolerade från serumprov, men denna metod är också lämplig för etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och citrerade plasma och kan också utökas till andra kroppsvätskor såsom urin, bröstmjölk, saliv, cerebrospinalvätska, och sperma. Detta protokoll kan dessutom justeras för karaktärisering av EVs från cell cellkulturer. I detta protokoll, EV suspensionen genererades från 100 μL serum med användande av exosome nederbörd reagens, som innehåller en patentskyddad polymer som försiktigt påskyndar exosomes och EVs enligt en korpuskulära storlek alltifrån 30 nm till 200 nm, whereby 10-20 μL volontärtjänstens utsågs för karakterisering av varje yta markör. Tyvärr, steget isolering är oundvikligt, eftersom den höga mängden protein i serumprover (exempelvis albumin och globulin) stör antikroppen färgning förfarande och resulterar i hög bakgrund och sofistikerade resultat. Dessutom måste utifrån biologiska tillgänglighet av exosomes i proven, mängden sysselsatta EV fjädringen liksom utspädningen före bearbetning justeras för andra råvaror. Att jämföra flera prover, en standardiserad metod för utspädning av de prov samt konsekvent förvärv parametrar (känslighet, slutare, etc.) är nödvändigt. En annan viktig punkt är att mätningarna inte startas förrän drivan är låg (i våra händer, < 5 μm/s). Om drivan var alltför hög, upprepade mätningar av provet gav hög standardavvikelse sinsemellan, men med en låg drift, resulterande data var mycket konsekvent och bekräftade en hög reproducerbarhet. Det är viktigt att de valda antikropparna har en lämplig fluorokrom. Antikroppar måste vara konjugerat med Alexa Fluor 488, eftersom FITC har en hög foto-blekning. Möjligen kommer mer stabil fluophores säkerligen leda till ökad assay stabilitet i framtiden. Normalt använder många forskare PBS som ett spädningsmedel för EVs. För detta protokoll är det viktigt att använda destillerat vatten som ett spädningsmedel för EV upphängningarna. När EVs är märkta med fluorescerande färger, höga osmolalitet och jonkoncentration av andra spädningsvätskor, såsom PBS, kan störa mätningen och leda till förändrad resultat.
Medan metoder för analys av EVs har förbättrats avsevärt under det senaste decenniet, finns det fortfarande ingen standardiserad metod för isolering och karakterisering av EVs. Den stora nackdelen med flödescytometri, där EVs är ofta bundna till pärlor att ge en större yta, är att många EVs docka till ger en stark och detekterbara signal10tryckytan. SEM och TEM har nackdelen att beredning av prover är tidskrävande och EVs kan endast skiljas genom sin storlek och morfologi11. Upp till datum, översättningsföretag och vanligaste metoden för kvalitativa (dvs biokemiska) är EV karakterisering Western blotting, där proteiner kan analyseras med specifika antikroppar12,13. Nackdelarna med alla dessa metoder ligger däremot i en oförmåga att analysera enstaka EVs för specifika yta markörer. Dessutom innefatta de långa handläggningstider och lång tvätt/isolering-förfaranden som används av många av de aktuella protokollen arbetsintensiva steg, vilket gör dem inte lämpar sig för hög provkapacitet och karakterisering av enda EVs. Våra protokoll ger en komplett arbetsflöde för snabb isolering och karakterisering av enda EVs med specifika yta markörer såsom CD63, CD9, vimentin och CD107a och kan utökas för ett brett spektrum av andra yta markörer att fastställa ursprunget på släppta EVs. På grund av en permanent teknisk befordran av NTA enheten bekräftade vi våra fynd i samarbete med tillverkaren med nyaste analyzer. Oavsett framtida utveckling av forskning om EV biologi, särskilt när det gäller exosomes, ger det protokoll som presenteras här en snabb och tillförlitlig metod för karakterisering av enda EVs specifika markörer. Eftersom aggregering av EVs under isolering och färgningsproceduren är hittills oundvikligt, bör framtida forskning fokusera på att utveckla metoder för att förhindra EV aggregering och möjliggöra en korrekt storleksbestämning av lysrör-märkt EVs.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka partikel Metrix GmbH för att delvis täcka kostnader publiceringen av detta arbete.
Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |