분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션
Summary
가장자리 지역 B 세포 (MZBs) 다시 흐름을 그들의 마이그레이션 경로 향하는 여 전단 흐름의 힘에 응답할. 이 프로토콜에는 기록 하 고 분석 응용 장치, 펌프, 현미경 이미징 시스템, 그리고 무료 소프트웨어를 사용 하 여 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.
Abstract
가장자리 지역 B 세포 (MZBs)는 낭 봉투 마우스 비장 한계 영역에 있는 B 세포의 인구. 모 낭에 도달, 혈액 흐름의 전단 힘을 MZBs 마이그레이션 해야 합니다. 선물이 여기 생체 외에서이 흐름 유도 MZB 마이그레이션 분석 하는 방법. 첫째, MZBs 마우스 비장 으로부터 격리 됩니다. 둘째, MZBs 흐름 챔버 슬라이드에서 integrin ligands에 정착, 전단 흐름에 노출 되며 마이그레이션 동안 현미경 이미지. 셋째, 이미지는 마이그레이션할 MZBs의 MTrack2 자동 셀 ImageJ를 위한 플러그인을 추적을 사용 하 여 처리 되 고 결과 셀 트랙 Ibidi chemotaxis 도구를 사용 하 여 정량은. 마이그레이션 데이터 셀 이동 하는 얼마나 빨리, 얼마나 자주 그들은 방향을 변경, 전단 흐름 벡터의 이동 방향에 영향을 미치는 여부 및 어떤 integrin ligands 관련 공개. MZBs를 사용 하 고, 비록 메서드를 쉽게 전단 흐름의 힘에 응답 하는 백혈구의 마이그레이션 분석 하는 데 적용할 수 있습니다.
Introduction
면역 세포는 인체에서 가장 운동 셀 이며 종종 혈액과 림프 흐름에서 전단 힘에 맞설 해야 합니다. 그러나, 백혈구1,2,3,,45의 전단 힘 유도 마이그레이션에 비교적 몇 가지 연구 있다. 선물이 여기 흐름 체 외에 면역 세포의 응답을 분석 하는 안정적이 고 양적 프로토콜. 수행 하는 분석 결과의 구성 요소, 제조 필요 하지 않습니다 그리고 모든 장비 및 소모품을 상업적으로 사용할 수 있습니다. 프로토콜, 세포 정화 및 마이그레이션 분석을 포함 하 여 하루에 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 한계 영역 B 세포 (MZBs)의 마이그레이션 설명, 비록 프로토콜 마이그레이션 다른 종류의 면역 세포의 흐름에 대해 분석 하 적응 될 수 있다. 따라서, 그것은이 분석 결과 사용 하 여 조건의 종합 패널 백혈구의 광범위 한 범위를 체계적으로 분석 가능 합니다.
MZBs, 마우스에서 발견 되는 비장에 셔틀만 B 세포의 인구는 여 포의 인테리어와 한계 영역6,7,,89. 한계 영역 면역 세포 약 5-10 셀 두께의 계층입니다. 셀 레이어 봉투 뿌리 하 고 MZBs와 대 식 세포 또한 고정 자연적인 살인자 T (iNKT) 세포, 모 수석 세포 (DCs), 및 호 중구, 다른 사람의 사이에서10주로 이루어져. 한계 영역에서 셀은 뿌리를 둘러싼 한계 부 비 동에 종료 비장 동맥에서 발생 하는 단방향 혈에 노출 됩니다. 혈액 한계 영역을 통해 한계 공동에 구멍에서 흐르는 고 빨간 펄프에서 정 맥 sinuses에 수집 이며 순환11복원. 혈액의 자유로운 흐름은 MZBs 이상 세척 하 고 혈액에 항 원에 노출. MZBs와 혈액에 노출 되지 않습니다, 뿌리의 내부 한계 영역 사이 자동으로 왕복 하 여 뿌리에 항을 수행. 따라서, 뿌리 쪽으로 MZBs 셔틀로 그들은 혈액 흐름12 (그림 1A)의 전단 힘을 마이그레이션 해야 합니다.
이 프로토콜에서 양적 어떻게 면역 세포와 같은 MZBs 아무 흐름 또는 높은 흐름 체 외에 응답을 결정 하는 방법을 설명, 그들은 어떻게 공개 하기 에 비보를 마이그레이션할 프로그램. 첫 번째 단계에서 MZBs 자석 구슬 상용 키트에서 항 체 결합을 사용 하 여 마우스 비장에서 순화 된다. 갓 격리 MZBs 흐름 챔버 슬라이드의 우물에 도입, integrin ligands에 정착 수 있으며 펌프 시스템 (그림 2A)를 사용 하 여 마이그레이션 버퍼의 흐름에 노출. 셀 시간 경과 비디오 현미경 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있습니다. 이미지 무료 ImageJ 플러그인, MTrack213,14, 셀을 자동으로 추적 하는 분석에 대 한 처리 됩니다. 트랙 속도, 직진도, 및 마이그레이션 인덱스를 포함 하 여 다양 한 매개 변수를 확인 하려면 무료 Ibidi Chemotaxis 도구15 다음 측정할 수 있습니다. 이러한 값 vivo에서 면역 세포 움직임을 제어 하는 힘을 이해 하기 위해서는 전단 흐름 유도 마이그레이션에 마이그레이션 억제제, 세포 자극, 발산, 및 다른 마이그레이션에 영향을 미치는 화학 물질의 효과 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 전단 흐름의 힘을 감지 하 고 그들의 마이그레이션 변경 하 여 응답 하는 셀의 마이그레이션 분석 하는 방법을 설명 합니다. MZBs의 분석이 보여주었다 MZBs 마이그레이션 저절로 ICAM-1과 흐름의 존재, 흐름을 마이그레이션할 것입니다. 우리의 이전 작품에서는, 우리는 MZBs VCAM-1에 흐름을 마이그레이션하지 마십시오 하지만 대신 자리에 고정 남아 보였다. Murine 비장 한계 영역 되어 주로 ICAM-1, 빨…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 K. 시티에 “도이치 가운데” SFB 854/TP11에서 교부 금에 의해 지원 되었다
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
