小鼠边缘区 b 细胞剪切流诱导迁移的体外分析
Summary
边缘区 b 细胞 (mzb) 通过调整其迁移路径的方向来响应剪切流的力。该协议演示了如何使用流体单元、泵、显微镜成像系统和自由软件记录和分析迁移。
Abstract
边缘区 b 细胞 (mzb) 是一种 b 细胞的群体, 它们位于包裹毛囊的小鼠脾边缘区。要到达毛囊, mzb 必须迁移血液流动的剪切力。本文提出了一种分析这种流动诱导的 mzb 体外迁移的方法。首先, mzb 从小鼠脾脏中分离出来。其次, mzb 在流动室滑块中的整合素配体上进行了确定, 暴露在剪切流中, 并在迁移过程中在显微镜下成像。第三, 迁移 mzb 的图像使用 imagej 的 mtrack2 自动单元跟踪插件进行处理, 并使用 ibidi 趋化工具对生成的单元跟踪进行量化。迁移数据揭示了细胞移动的速度、它们改变方向的频率、剪切流矢量是否影响其迁移方向以及涉及哪些整合素配体。虽然我们使用 mzb, 该方法可以很容易地适应分析任何白细胞的迁移, 响应剪切流的力量。
Introduction
免疫细胞是人体中运动最强的细胞, 往往必须与血液和淋巴流动的剪切力抗衡。然而, 关于白细胞1、2、3、4、5的剪切力诱导迁移的研究相对较少。我们在这里提出了一个可靠的定量协议, 以分析免疫细胞在体外流动的反应。执行检测不需要制造组件, 所有设备和耗材均可在市场上获得。该协议, 包括细胞纯化和迁移分析, 可以在一天内完成。最后, 尽管我们描述了边缘区 b 细胞 (mzb) 的迁移, 但该协议可以用来分析其他类型免疫细胞的迁移。因此, 使用该方法系统地分析广泛的白细胞, 并对其进行全面的条件分析是可行的。
mzb 是 b 细胞的群体, 在小鼠体内, 仅存在于毛囊内部和边缘区 6、7、8、9之间的脾脏和穿梭。边缘区域是一层大约5-10 个厚的免疫细胞。细胞层包裹毛囊, 主要由 mzb 和巨噬细胞组成, 但也包括不变的自然杀手 t (inkt) 细胞、树突状细胞 (dc) 和中性粒细胞等10。边缘区域的细胞暴露在来自脾动脉的单向血流中, 这些血流终止于卵泡周围的边缘窦。血液从边缘窦的洞中通过边缘区域流动, 然后收集在红色果肉中的静脉窦, 并恢复到循环11。血液的自由流动在 mzb 上冲走, 使它们暴露在血液中携带的抗原中。mzb 通过在边缘区域和毛囊内部之间自动穿梭, 将抗原带入毛囊, 而毛囊不受血液影响。因此, 当 mzb 向毛囊穿梭时, 它们必须迁移血流12的剪切力 (图 1a).
在这个协议中, 我们描述了如何定量地确定免疫细胞 (如 mzb) 在体外对无流动或高流量的反应, 以揭示它们是如何被编程在体内迁移的。在第一步中, mzb 从老鼠脾脏中纯化, 使用磁珠与市售试剂盒中的抗体结合。新隔离的 mzb 被引入流动室滑块的井中, 允许安装在整合素配体上, 并使用泵系统暴露在迁移缓冲流中 (图 2 a)。这些细胞是使用延时视频显微镜系统成像的。然后使用免费的 imagej 插件 mtrack2 13, 14对图像进行分析, 以自动跟踪细胞。然后, 可以使用免费的 ibidi 趋化工具15对轨迹进行量化, 以确定各种参数, 包括速度、直线度和迁移指数。这些值可用于确定迁移抑制剂、细胞刺激器、趋化因子和其他影响迁移的化学品对剪切流诱导迁移的影响, 以了解控制体内免疫细胞运动的力量。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们在这里描述了一种方法来分析细胞的迁移, 检测剪切流的力量, 并通过改变它们的迁移来响应。对 mzb 的分析表明, mzb 在 icam-1 上自发迁移, 在流动的情况下, 会向上迁移流动。在前面的工作中, 我们展示了 mzb 不会在 vcam-1 上向上迁移流, 而是保持固定在适当的位置。小鼠脾边缘区主要含有 icam-1, 而红浆中含有 icam-1 和 vcam-1。从这些数据中可以推断, mzb 会在边缘区向上迁移流动, 但不会在红色纸浆…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 “德意志论坛” sfb 854/tp11 至 k. d. f 的赠款。
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
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