Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Mekanisk Micronization af Lipoaspirates for regenerativ terapi

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/58765
Automatic Translation
1, 1, 1, *1, *1
1Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at opnå stromale vaskulære brøkdel af fedtvæv gennem en serie af mekaniske processer, som omfatter emulgering og flere centrifugations.

Abstract

Stromale vaskulære brøkdel (SVF) er blevet en regenerativ værktøj for forskellige sygdomme; men regulerer lovgivningen strengt den kliniske anvendelse af celle produkter ved hjælp af collagenase. Vi præsenterer her, en protokol for at generere en injicerbar blanding af SVF celler og indfødte ekstracellulære matrix fra fedtvæv af en rent mekanisk proces. Lipoaspirates er sat i en centrifuge og spundet på 1.200 x g i 3 min. Det midterste lag er samlet og opdelt i to lag (high-density fedt nederst) og low-density fedt på toppen. Det øverste lag er direkte emulgeret med intersyringe flytte, med en hastighed på 20 mL/s til 6 x og 8 x. Emulgerede fedt centrifugeres ved 2.000 x g i 3 min, og den klæbende stof under olien lag er indsamlet og defineret som den ekstracellulære matrix (ECM) / SVF-gel. Olie på det øverste lag er indsamlet. Ca. 5 mL olie er føjet til 15 mL af high-density fedt og emulgeret med intersyringe flytte, med en hastighed på 20 mL/s til 6 x og 8 x. Emulgerede fedt centrifugeres ved 2.000 x g i 3 min, og en klæbrig substans er også ECM/SVF-gel. Efter transplantation af ECM/SVF-gel til nøgen mus er podekvisten høstet og vurderet ved histologisk undersøgelse. Resultatet viser, at dette produkt har potentiale til at regenerere i normal fedtvæv. Denne procedure er en enkel, effektiv mekanisk dissociation procedure at kondensere SVF celler integreret i deres naturlige støttende ECM til regenerativ formål.

Introduction

Stamcelleterapier giver et paradigmeskift for væv reparation og regeneration, så de kan tilbyde en alternativ terapeutiske regime for forskellige sygdomme1. Stamceller (fx, inducerede pluripotente stamceller og embryonale stamceller) har store terapeutiske potentiale, men er begrænset på grund af celle regulering og etiske overvejelser. Fedt-afledt mesenchymale stromale/stamceller (ASCs) er let at opnå fra lipoaspirates og ikke underlagt de samme begrænsninger; Det er således blevet en ideel celletype for praktiske regenerativ medicin2. Desuden, de er nonimmunogenic og har rigelige ressourcer fra autologt fedt3.

I øjeblikket er ASCs fremstillet primært ved collagenase-medieret nedbrydning af fedtvæv. De stromale vaskulære brøkdel (SVF) af fedtvæv indeholder ASCs, endotel stamfader celle, pericytes og immunceller. Selv om at opnå en høj tæthed af SVF/ASCs enzymatisk blev vist sig at have gavnlige virkninger, regulerer lovgivningen i flere lande nøje klinisk anvendelse af celle-baserede produkter ved hjælp af collagenase4. Fordøje fedtvæv med collagenase for 30 min til 1 time at få SVF celler øger risikoen for begge eksogene materiale i forberedelse og biologisk forurening. Den vedhængende kultur og rensning af ASCs, som tager dage til uger, kræver specifikke laboratorieudstyr. Desuden, i de fleste undersøgelser, SVF celler og ASCs bruges i suspension. Uden beskyttelse af ekstracellulære matrix (ECM) eller et andet flyselskab, gratis celler er sårbare, forårsage en dårlig celle opbevaring efter injektion og kompromittere terapeutiske resultatet5. Af alle disse grunde begrænser den videre anvendelse af stamcelleterapi.

For at opnå ASCs af fedtvæv uden collagenase-medieret fordøjelse, har flere mekaniske forarbejdningsprocesser, herunder centrifugering, mekanisk hakning, neddeling, purere og hakkes, været udviklet6,7 , 8 , 9. disse metoder er troede at kondensere væv og ASCs af mekanisk forstyrre modne adipocytter og deres olie-holdige vesikler. Desuden, disse præparater, der indeholder høje koncentrationer af ASCs, viste betydelige terapeutiske potentiale som regenerativ medicin i animalske modeller8,9,10.

I 2013 indført Tonnard et al. nanofat podning teknik, der involverer producerer emulgerede lipoaspirates af intersyringe behandling af11. At klipning kraft skabt af intersyringe skiftende kan selektivt bryde modne adipocytter. Baseret på deres resultater, udviklet vi et rent mekanisk forarbejdningsmetode, der fjerner de fleste af lipid og væske i lipoaspirates, forlader kun SVF celler og fraktionerede ECM, som er ECM/SVF-gel12. Heri, beskrive vi detaljerne i den mekaniske proces af menneske-afledte fedtvæv til at producere ECM/SVF-gel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne forskning blev godkendt af den etiske Review Board i Nanfang Hospital, Guangzhou, Kina. Fedtvæv er indsamlet fra raske donorer, der gav skriftligt informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen. Alle dyreforsøg blev godkendt af det Nanfang Hospital institutionelle Animal Care og brug udvalg og udført efter retningslinjerne for National sundhed og Medical Research Council (Kina).

1. ECM/SVF-gel forberedelse

  1. Høst fedt.
    1. Udføre Fedtsugning på et menneske med en 3-mm multiport kanyle, som indeholder flere skarpe side huller på 1 mm i diameter,-0.75 atm af sugetryk.
    2. Indsamle 200 mL af lipoaspirates i en steril pose.
  2. Forberede Coleman fedt.
    1. Overføre lipoaspirates i fire 50 mL rør og tillade den høstede fedt at stå stille i 10 min.
    2. Indsamle fedt på det øverste lag i to 50 mL rør ved hjælp af wide-tip pipette til at overføre, og kassér den flydende del på det nederste lag.
    3. Bruger 50 mL rør, centrifugate det fedtlag på 1.200 x g ved stuetemperatur (RT) for 3 min.
    4. Definere det øverste lag (ca. 80 mL) som Coleman fedt.
    5. Overføre de øverste 2/3 af Coleman fedt til en 20 mL rør ved hjælp af wide-tip pipette, og definere denne del som low-density fedt.
    6. Overføre den nedre 1/3 af Coleman fedt til et andet 20 mL rør ved hjælp af wide-tip pipette, og definere denne del som high-density fedt.
  3. Producere ECM/SVF-gel fra low-density fedt.
    1. Bruge to 20 mL sprøjter forbundet af en kvinde til kvinde Luer-Lock stik (med en indre diameter på 2,4 mm) for at intershift 20 mL af low-density fedt.
    2. Holde den skiftende hastighed stabil (på 20 mL/s) og Gentag til 6 x og 8 x.
    3. Centrifugate blanding på 2.000 x g på RT for 3 min.
    4. Indsamle delen olie på toppen i et 10 mL rør ved hjælp af wide-tip pipette på RT for yderligere brug.
    5. Indsamle de klæbrig substans i det midterste lag, som er ECM/SVF-gel (fig. 1A), ved hjælp af wide-tip pipette, og kassér væske på det nederste lag.
  4. Producere ECM/SVF-gel fra high-density fedt.
    1. Tilsættes 5 mL olie (indsamlet fra trin 1.3.4) 15 mL af high-density fedt.
    2. Intershift blandet fedt mellem sprøjter 6 x til 8 x indtil en fnug er observeret inden for emulsion.
    3. Centrifugate blanding på 2.000 x g på RT for 3 min.
    4. Kassér delen olie på toppen.
    5. Indsamle de klæbrig substans i det midterste lag (ECM/SVF-gel) ved hjælp af wide-tip pipette og kassér væske på det nederste lag.
    6. Bland ECM/SVF-gel fra trin 1.3.5 og 1.4.5.

2. nøgen mus ECM/SVF-gel Graft Model

  1. Bedøver nøgen mus (8 uger gamle, kvindelige) med isofluran (1% - 3%) inhalation anæstesi i en dyr operation room.
  2. Overføre ECM/SVF-gel til en 1 mL sprøjte.
  3. Tilslut 1 mL sprøjte med en stump infiltration kanyle.
  4. Isæt kanylen subkutant i hver flanke af musen.
  5. Injicere 0,3 mL af ECM/SVF-gel.

3. Vævscentre høst på 3, 15 og 90 dage efter ECM/SVF-gel injektion

  1. Bedøver mus med isofluran (1% - 3%) inhalation anæstesi.
  2. Ofre mus ved metoden cervikal dislokation.
  3. Gøre et snit på midterlinjen af musens dorsale huden med kirurgisk saks.
  4. Dissekere og høste de fedt podninger på begge sider af musen. Integrere fedt graftene i 4% PARAFORMALDEHYD på RT natten over.
  5. Dehydrere væv i stigende koncentrationer ethanol: 70% ethanol, to ændringer, 1 h hver; 80% ethanol, en ændring, 1 h; 95% ethanol, en ændring, 1 h; 100% ethanol, tre ændringer, 1,5 h hver; xylen, tre ændringer, 1,5 h.
  6. Infiltrere væv med paraffinvoks (58-60 ° C), to ændringer, 2 h.
  7. Integrere vævet i paraffinblokke. Skær sektioner på en tykkelse af ca 4 µm og læg dem på dias.

4. hæmatoxylin og Eosin pletter

  1. Deparaffinize paraffin blok dias af iblødsætning dem i xylen I, II og III (10 min).
  2. Rehydrere afsnittene væv af passerer dem gennem faldende koncentrationer (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) af ethanol bade i 3 min.
  3. Skyl afsnittene væv i destilleret vand (5 min).
  4. Pletten afsnittene væv i hæmatoxylin i 5 min.
  5. Skyl afsnittene væv i rindende vand i 20 min. Decolorize i 1% syre alkohol (1% HCl i 70% alkohol) for 5 s. skylles i rindende vand, indtil sektionerne er blå igen.
  6. Tilføje to til tre dråber af Eosin Y farvestof direkte på dias med pipette, og lad farvestoffet sæt i 10 min.
  7. Vask dias i vand fra hanen i 1-5 min.
  8. Dehydrere dias i stigende koncentrationer (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) ethanol i 3 min.
  9. Fjern dias i xylen I og II i 5 min.
  10. Montere dias i montering medier.

5. immunfluorescent farvning

  1. Deparaffinize væv sektioner i xylen I, II og III (5 min).
  2. Rehydrere afsnittene væv af passerer dem gennem forskellige koncentrationer (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) af alkohol bade i 3 min.
  3. Inkuber sektioner i en 3% H2O2 opløsning i methanol på RT for 10 min.
  4. Skyl dias 2 x med destilleret vand, 5 min.
  5. Drop diasene i et dias kurv. Tilsaettes 300 mL 10 mM citratbuffer (pH 6.0) og glassene inkuberes ved 95-100 ° C i 10 min.
  6. Cool dias i RT i 20 min.
  7. Skyl dias 2 x med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), 5 min.
  8. Tilsæt 100 µL af 10% føtal bovin serum på dias og Inkuber i et befugtet kammer på RT for 1 h.
  9. Inkuber sektioner med primær antistof løsning (marsvin anti-mus Perilipin, 1: 400) ved 4 ° C natten over.
  10. Skyl dias med PBS 3 x, 5 min hver.
  11. Inkuber sektioner med sekundær antistof løsning (ged anti-guinea gris-488 IgG) i 2 timer ved RT.
  12. Skyl dias med PBS 3 x, 5 min hver.
  13. Aftørre vand omkring sektion med ren silkepapir.
  14. Drop 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og Alexa Fluor 488-konjugeret isolectin ind i cirkel til at dække afsnittet på diaset.
  15. Montere coverslips og lad dem tørre i mørke.
  16. Observere dias med et fluorescerende mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter forarbejdning Coleman fedt til ECM/SVF-gel, mængden af kasserede olie fylder 80% af det endelige rumfang, og kun 20% af fedtvæv bevaret under olien lag betragtes som ECM/SVF-gel (fig. 1A). ECM/SVF-gel har en glat væske-lignende tekstur, der gør det muligt at gå gennem en 27 G fin nål; men Coleman fedt består af en integreret adipøst struktur med store fibre og kan kun gå gennem en 18 G kanyle (figur 1B).

Dag 3 efter transplantation syntes stort antal små preadipocytes med flere intracellulære lipid dråber, omfattende godt vaskulariserede bindevæv og infiltreret inflammatoriske celler. Begynder på dag 15, antallet af inflammatoriske celler begyndte at få reduceret gradvist, og adipocytter begyndte at modne. Ved dag 90, havde de fleste af de vaskulariserede bindevæv i podninger erstattet af modne adipocytter (figur 2, øverste panel).

ECM/SVF-gel grafts indeholdt et par perilipin-positive adipocytter, 3 dage efter transplantation. Små preadipocytes med flere intracellulære lipid dråber begyndte at dukke op på dag 15. Hvert felt af ECM/SVF-gel pode sektioner på dag 90 viste adskillige perilipin-positive adipocytter og nydannede blodkar (figur 2, nederste panel).

Figure 1
Figur 1 : Billeder af ECM/SVF-gel. Centrifugeret Coleman fedt og ECM/SVF-gel efter forarbejdning (A). ECM/SVF-gel kan injiceres let gennem en nål for 27 G; Coleman fedt kan dog kun passere gennem en 18 G kanyle (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Histologiske forandringer i ECM/SVF-gel efter transplantation. ECM/SVF-gel viste omfattende godt vaskulariserede bindevæv og infiltrerer inflammatoriske celler på dag 3. Senere, de fleste af de vaskulariserede bindevæv blev erstattet af en struktur, der indeholder modne adipocytter (øverste panel). Immunfluorescent farvning viser at de fleste af væv består af området perilipin-negativ på dag 3. Dag 15 syntes en stor del af perilipin + adipocytter. Talrige perilipin-positive adipocytter blev fundet efter 90 dage (nederste panel). Skala barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stamcelle-baseret regenerativ terapi har vist en stor potentiel fordel i forskellige sygdomme. ASCs er udestående terapeutiske kandidater, fordi de er nemme at få og have kapacitet til væv reparation og regenerering af roman væv15. Der er dog begrænsninger til at udvide sin kliniske anvendelse, da det kræver komplicerede procedurer at isolere cellerne og collagenase til behandling af6. Det er således vigtigt at udvikle en enkel teknik for at få stamceller uden brug af collagenase.

I denne undersøgelse præsenterede vi en rent mekanisk proces af fedtvæv at opnå SVF celler, som er beskyttet af de indfødte adipøst ECM. Denne proces er desuden collagenase-fri. En tidligere undersøgelse sammenlignede forskellige intersyringe sagsbehandlingstider og viste, at den intersyringe behandling af standard Coleman fedt for 1 min med en væskehastighed på 10 mL/s er den optimale protokol for at producere ECM/SVF-gel12. Ved hjælp af intersyringe skiftende, ødelægges de fleste adipocytter i lipoaspirates med de fleste af SVF celler og ECM bevaret. Intersyringe skiftende er således det vigtigste skridt i hele processen. Den intersyringe skiftende hastighed og tidsforbrug på gennemførelse af de skiftende bestemme niveauet ødelæggelse af fedtvæv fordi den sheering kraft skabt af den intersyringe proces er knyttet til de skiftende hastighed. Vi foreslår, at de skiftende hastighed skal være stabilt på 20 mL/s. utilstrækkelig destruktion fører til resterende uønskede adipocytter, mens overdestruction resulterer i skadelige SVF celler. Produktet af denne protokol kan defineres som ECM/SVF-gel, kun hvis det nået følgende kriterier: 1) sin endelige rumfang er ~ 20% af den oprindelige mængde; 2) det er nemt sprøjtes gennem en 27 G kanyle. En tidligere undersøgelse viste, at ECM/SVF-gel indeholder høje tætheder af begge CD45-/ CD31- / CD34 + ASCs og SVF celle tæthed er > 4,0 x 105 celler/mL12.

Under processen med at skabe ECM/SVF-gel, blev centrifugering gennemført 2 x før og efter intersyringe flytte. Før intersyringe skiftende, bruger vi centrifugering oprette "graded tætheder" af fedt. Dette er et andet vigtigt skridt. Det er blevet bevist, at den high-density fedt lag på bunden, efter centrifugering, er rig på kondenseret ECM men har mindre olie, mens det low-density fedt lag på toppen har mere olie, men mindre ECM fiber16,17. Disse to lag bør således behandles på to forskellige måder. Low-density fedt kan direkte gennemgå intersyringe behandling for at ødelægge adipocytter. High-density fedt på det nederste lag kræver imidlertid yderligere olie lette ødelæggelse af adipocytter. Den ekstra olie kan nedsætte tætheden af high-density fedt, hvilket gør den skiftende meget lettere. Derudover kan olie hjælpe udvinde mere olie fra de ødelagte adipocytter; men vandig væske kan ikke. Dermed, vi tilføjet ekstra olie til high-density fedt. Centrifugering efter intersyringe skiftende er at adskille olien del fra SVF celler og ECM. Olie bør undgås i det endelige produkt.

Transplantation af ECM/SVF-gel resulterede i en stor tilbageholdelse. Som vi nævnte ovenfor, den centrale trin i behandlingen af ECM/SVF-gel er intersyringe skiftende, som ødelægger de fleste af adipocytter. Således forblev lille adipocytter i ECM/SVF-gel. Som vist i figur 2, en lille perilipin-positive område dukkede op i den transplanterede ECM/SVF-gel på dag 3. Dog efter 15 dage, masser af perilipin-positive adipocytter optrådte og blev modne efter 90 dage. En tidligere undersøgelse har vist, at transplantation af ECM/SVF-gel induceret vært celle-medieret fedtvæv regenerering14. Bruger-anti-human leukocyt antigen til at identificere oprindelsen af de nydannede adipocytter, opdagede vi, at selv om de fleste af cellerne i SVF var graft-stammer, de fleste af de nydannede fedtvæv var vært-afledte. ECM/SVF-gel har en stor regenerativ funktion, som vi tidligere rapporteret. Dette produkt havde store terapeutiske effekter i sårheling12. Desuden hjalp det for at forbedre overlevelsesraten for den gratis klap i en musemodel af accelererende angiogenese10.

SVF-gel er en autolog injicerbar indeholdende indfødte ECM og funktionelle cellulære komponenter. Produktet er genereret fra lipoaspirate af en simpel mekanisk proces, der kan udføres nemt uden nogen bekymringer med hensyn til reguleringsspørgsmål. Regenerativ effekten af ECM/SVF-gel er dog fortsat uklart. For at bedre karakteriserer de gavnlige virkninger af ECM/SVF-gel, er yderligere undersøgelser til at karakterisere de underliggende molekylære mekanismer af regenerativ effekten af ECM/SVF-gel på måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National karakter Science Foundation i Kina (81471881, 81601702, 81671931), Natural Science Foundation i Guangdong provinsen i Kina (2014A030310155), og Administrator fundament af Nanfang Hospital (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 Molecular Probes I21411
guinea pig anti-mouse perilipin Progen GP29
DAPI Thermofisher D1306
wide tip pipet Celltreat 229211B
Confocal microscope  Leica  TCS SP2
nude nice  Southern Mdical University /
light microscope  Olympus /
50 mL tube Cornig 430828
sterile bag Laishi /
microtome Leica  CM1900
centrifuge Heraus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  2. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
  3. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
  4. Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
  5. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  6. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  7. van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
  8. Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
  9. Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
  10. Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
  11. Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
  12. Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
  13. Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
  14. Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
  15. Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
  16. Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
  17. Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).

Tags

Medicin sag 145 fedtholdigt-afledte stamceller mekanisk proces lipoaspirates fedt podning stamcelleterapi stromale vaskulære brøkdel gel
Mekanisk Micronization af Lipoaspirates for regenerativ terapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, H., Ge, J., Chen, X., Lu, F.,… More

Zhu, H., Ge, J., Chen, X., Lu, F., Cai, J. Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy. J. Vis. Exp. (145), e58765, doi:10.3791/58765 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter