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Biochemistry

संरचना और Nucleosomes की गतिशीलता परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग कर की जांच

Published: January 31, 2019
doi:
10.3791/58820
, , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

यहां, हम स्थैतिक और समय चूक परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर एकल-अणु स्तर पर nucleosome कणों की विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । सतह functionalization विधि वर्णित संरचना और नेनो में उच्च संकल्प में nucleosomes की गतिशीलता के कब्जा के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

क्रोमेटिन, जो nucleosome उपइकाईयों की एक लंबी श्रृंखला है, एक गतिशील प्रणाली है कि डीएनए प्रतिकृति और प्रतिलेखन के रूप में ऐसी महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के लिए अनुमति देता है eukaryotic कोशिकाओं में जगह ले रहा है । nucleosomes की गतिशीलता प्रतिकृति और प्रतिलेखन मशीनरी द्वारा डीएनए तक पहुंच प्रदान करता है, और गंभीर आणविक क्रोमेटिन कार्यों अंतर्निहित तंत्र के लिए योगदान देता है । परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) इमेजिंग के रूप में एकल अणु अध्ययन nucleosome संरचना और गतिशीलता की भूमिका की हमारी वर्तमान समझ के लिए काफी योगदान दिया है । वर्तमान प्रोटोकॉल nucleosomes के संरचनात्मक और गतिशील गुणों का अध्ययन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन AFM इमेजिंग तकनीकों को सक्षम करने वाले चरणों का वर्णन करता है । प्रोटोकॉल centromere nucleosomes के लिए प्राप्त AFM डेटा से सचित्र है जिसमें H3 हिस्टोन अपने समकक्ष centromere प्रोटीन ए (CENP-ए) के साथ प्रतिस्थापित किया गया है । प्रोटोकॉल मोनो-nucleosomes के विधानसभा के साथ शुरू होता है एक सतत कमजोर पड़ने विधि का उपयोग कर । मीका aminopropyl silatrane (ए पी एस-मीका) है कि nucleosome इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ कार्यात्मक सब्सट्रेट की तैयारी वर्णित nucleosomes के AFM दृश्य के लिए महत्वपूर्ण है और प्रक्रिया सब्सट्रेट तैयार करने के लिए प्रदान की जाती है । ए पी एस-मीका सतह पर जमा Nucleosomes पहले स्थैतिक AFM है, जो nucleosome आबादी का एक स्नैपशॉट कब्जा का उपयोग कर रहे हैं । इन छवियों के विश्लेषण से, nucleosomes के आसपास लिपटे डीएनए के आकार के रूप में इस तरह के मापदंडों मापा जा सकता है और इस प्रक्रिया को भी विस्तृत है । समय-चूक AFM इमेजिंग प्रक्रिया में तरल उच्च-गति समय-चूक AFM जो प्रति सेकंड nucleosome dynamics के कई फ़्रेंस कैप्चर कर सकते हैं के लिए वर्णन किया गया है । अंत में, गतिशील प्रक्रियाओं के मात्रात्मक लक्षण को सक्षम करने nucleosome गतिशीलता के विश्लेषण का वर्णन किया गया है और सचित्र ।

Introduction

eukaryotic कोशिकाओं में, डीएनए अत्यधिक गाढ़ा और गुणसूत्रों में आयोजित किया जाता है । 1 एक गुणसूत्र के भीतर डीएनए संगठन के पहले स्तर nucleosomes की विधानसभा है जिसमें १४७ डीएनए का बीपी कसकर एक हिस्टोन octamer कोर के आसपास लिपटे है । 2 , 3 Nucleosome कणों एक लंबे डीएनए एक क्रोमेटिन सरणी है जो तो एक उच्च कॉंपैक्ट गुणसूत्र इकाई का गठन किया है जब तक आयोजित किया जाता है बनाने के अणु पर इकट्ठा । 4 क्रोमेटिन के विधानसभा इस तरह के जीन प्रतिलेखन और जीनोम प्रतिकृति के रूप में महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं द्वारा आवश्यक मुक्त डीएनए के लिए उपयोग प्रदान करता है, सुझाव है कि क्रोमेटिन एक अत्यधिक गतिशील प्रणाली है । 5 , 6 , 7 विभिंन क्रोमेटिन स्तरों पर डीएनए के गतिशील गुणों को समझना आणविक स्तर पर elucidating आनुवंशिक प्रक्रियाओं के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है जहां गलतियों कोशिका मृत्यु या कैंसर जैसे रोगों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । 8 महान महत्व के एक क्रोमेटिन संपत्ति nucleosomes की गतिशीलता है । 9 , 10 , 11 , 12 इन कणों के उच्च स्थिरता crystallographic तकनीक द्वारा संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी गई है । 2 क्या इन अध्ययनों की कमी ऐसे हिस्टोन कोर से unwrappinging डीएनए के तंत्र के रूप में nucleosomes के गतिशील विवरण हैं; जो की गतिशील मार्ग प्रतिलेखन और प्रतिकृति प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है । 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 इसके अलावा, विशेष प्रोटीन nucleosomal कणों के विधानसभा17की सुविधा के लिए दिखाया गया है remodeling कारकों का कार्यकाल; हालांकि, nucleosomes की आंतरिक गतिशीलता इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कारक है कि पूरे विधानसभा प्रक्रिया में योगदान देता है । 14 , 16 , 18 , 19

एकल अणु तकनीक जैसे एकल अणु प्रतिदीप्ति19,20,21, ऑप्टिकल ट्रैपिंग (चिमटी)13,18,22,23 और AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 nucleosomes की गतिशीलता को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । इन तरीकों के बीच, कई अनूठी और आकर्षक सुविधाओं से AFM लाभ । AFM एक कल्पना और व्यक्तिगत nucleosomes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अब27arrays विशेषता के लिए अनुमति देता है । AFM छवियों से, इस तरह के हिस्टोन कोर के आसपास लिपटे डीएनए की लंबाई के रूप में nucleosome संरचना के महत्वपूर्ण लक्षण 10,14,26,28मापा जा सकता है; एक पैरामीटर जो nucleosome unwrappinging गतिशीलता के लक्षण वर्णन के लिए केंद्रीय है । पिछले AFM अध्ययनों से पता चला है nucleosomes के लिए अत्यधिक गतिशील प्रणालियों और है कि डीएनए सहज हिस्टोन कोर14से खोलना कर सकते हैं । nucleosomes से डीएनए के सहज unwrappinging सीधे समय में AFM ऑपरेटिंग द्वारा visualized था चूक मोड जब इमेजिंग जलीय समाधान 14,26,29में किया जाता है ।

उच्च गति समय चूक AFM के आगमन (एच एस-AFM) इंस्ट्रूमेंटेशन यह मिलीसेकंड समय पैमाने 14,15,24पर nucleosome unwrappinging प्रक्रिया कल्पना करने के लिए संभव बना दिया । हाल ही में एच एस-AFM 16,centromere विशिष्ट nucleosomes के30 अध्ययनों में विहित प्रकार के साथ तुलना में nucleosomes के कई उपंयास सुविधाओं का पता चला । Centromere nucleosomes एक Centromere, गुणसूत्र के एक छोटे से हिस्से का गठन गंभीर गुणसूत्र अलगाव31के लिए महत्वपूर्ण है । बल्क क्रोमेटिन में विहित nucleosomes के विपरीत, centromere nucleosomes के हिस्टोन कोर में CENP हिस्टोन३२,३३के बजाय हिस्टोन-ए H3 होता है. इस हिस्टोन प्रतिस्थापन के एक परिणाम के रूप में, centromere nucleosomes में डीएनए लपेटन ~ १२० bp के बजाय विहित nucleosomes के लिए ~ १४७ bp है; एक अंतर है कि centromere और विहित nucleosomes arrays३४के विशिष्ट morphologies के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, सुझाव है कि centromere क्रोमेटिन उच्च एक थोक के साथ तुलना में गतिशीलता । इस उपंयास गतिशीलता एच एस में centromere nucleosomes द्वारा प्रदर्शित-AFM16,30 अध्ययन अद्वितीय इस एकल अणु तकनीक द्वारा प्रदान की संरचनात्मक और गतिशील गुणों की कल्पना को सीधे अवसर उदाहरण देना nucleosomes । इन सुविधाओं के उदाहरण संक्षेप में चर्चा की जाएगी और कागज के अंत में सचित्र । यह प्रगति nucleosomes के AFM इमेजिंग के लिए उपंयास प्रोटोकॉल के विकास के साथ ही मौजूदा तरीकों के संशोधनों के कारण किया गया था । प्रोटोकॉल का लक्ष्य यहां वर्णित एकल-अणु AFM nucleosome अध्ययन में इन रोमांचक अग्रिम करने के लिए किसी को भी, जो अपने क्रोमेटिन जांच में इन तकनीकों का उपयोग करना चाहते है सुलभ है । वर्णित तकनीकों के कई nucleosomes के अध्ययन से परे समस्याओं के लिए लागू कर रहे है और अंय प्रोटीन और ब्याज की डीएनए प्रणालियों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ऐसे आवेदनों के कुछ उदाहरण प्रकाशनों में पाया जा सकता है३५,३६,३७,३८,३९,४०,४१, ४२,४३,४४,४५,४६,४७,४८,४९ और AFM स्टडीज की संभावनाएं विभिन्ना आणविक प्रणालियों की समीक्षाएँ२९,५०,५१,५३,५४में दी गई हैं.

Protocol

1. मोनो-nucleosomes के सतत कमजोर पड़ने विधानसभा उत्पंन और एक लगभग ४०० बीपी डीएनए सब्सट्रेट है कि एक ऑफ-केंद्रित Widom ६०१ nucleosome पोजीशनिंग अनुक्रम शामिल शुद्ध । ५५नोट: डि-nucleosomes के अवांछित गठन को सीमित करन…

Representative Results

मोनो-nucleosomes पहले एक सतत कमजोर पड़ने वाली विधानसभा पद्धति (चित्रा 1) का उपयोग कर AFM इमेजिंग प्रयोगों के लिए तैयार थे. तैयार nucleosomes तो एसडीएस-पृष्ठ (चित्रा 2) का उपयोग कर जांच की गई । एक मीका स…

Discussion

इसके बाद के संस्करण वर्णित प्रोटोकॉल बल्कि सीधा है और उच्च reproducible परिणाम प्रदान करते हैं, हालांकि कुछ महत्वपूर्ण मुद्दों पर जोर दिया जा सकता है । कार्यात्मक ए पी एस-अभ्रक विश्वसनीय और reproducible परिणाम प्राप्…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखक योगदान: YLL और एमएसडी परियोजना डिजाइन; एमएसडी इकट्ठे nucleosomes । एमएसडी व ZS मध्यरात्री AFM उपाययोजना व लगत विश्लेषण होते. सभी लेखकों ने पांडुलिपि को लिखा और संपादित किया ।

Materials

Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
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Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).
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