Здесь мы представляем протокол характеризовать нуклеосома частиц на уровне одной молекулы, используя статические и time-lapse атомно-силовой микроскопии (АСМ) методы визуализации. Функционализация поверхности метод, описанный позволяет для захвата структуры и динамики нуклеосом в с высоким разрешением на наноуровне.
Хроматина, который является длинная цепь нуклеосома субблоков, является динамической системы, что позволяет для таких критических процессов репликации ДНК и транскрипции занять место в эукариотических клеток. Динамика нуклеосом предоставляет доступ к ДНК, механизмы репликации и транскрипции и критически способствует молекулярных механизмов, лежащих в основе функции хроматина. Сингл молекулярных исследований, таких как атомно-силовой микроскопии (АСМ) изображений значительно способствовали нашего нынешнего понимания роли нуклеосома структуры и динамики. Текущий протокол описывает шаги, позволяя разрешением AFM методы визуализации для изучения структурных и динамических свойств нуклеосом. Протокол иллюстрируется AFM данные, полученные для центромер нуклеосом, в которых гистонов H3 заменяется его коллегой центромер белков (CENP-A). Протокол начинается с Ассамблеей моно нуклеосом методом непрерывного разбавления. Подготовка подложки слюды, функционализированных с аминопропил silatrane (APS-слюда), которая используется для визуализации нуклеосома имеет решающее значение для AFM визуализации нуклеосом описал и процедура для подготовки субстрата. Нуклеосом на хранение на поверхности APS-слюда сначала отражаются с помощью статических AFM, который захватывает снимок населения нуклеосома. Из анализа этих изображений такие параметры, как размер ДНК, обернутые вокруг нуклеосом может быть измерена, и этот процесс также подробно. Покадровой AFM изображений процедура в жидкости описан для высокоскоростной покадровой AFM, которые могут захватить несколько кадров нуклеосома динамики в секунду. Наконец анализ динамики нуклеосома включение количественной характеристики динамических процессов описаны и проиллюстрированы.
В эукариотических клетках ДНК сильно уплотняется и организованы в хромосомы. 1 первый уровень ДНК Организации в пределах хромосомы является Ассамблея нуклеосом в которых 147 bp ДНК плотно обернутые вокруг гистона octamer ядро. 2 , 3 нуклеосома частицы собираются на длинные молекулы ДНК, образуя хроматина массив, который затем проводится до тех пор, пока блок весьма компактный Хромосома образуется. 4 Разборка хроматина обеспечивает доступ к свободной ДНК требует критического клеточных процессов, например ген транскрипции и генома репликации, предполагая, что хроматина является весьма динамичная система. 5 , 6 , 7 понимание динамических свойств ДНК на различных уровнях хроматина является критически важным для выяснения генетических процессов на молекулярном уровне, где ошибки могут привести к смерти клетки или развитие таких заболеваний, как рак. 8 хроматина свойство большое значение является Динамика нуклеосом. 9 , 10 , 11 , 12 структурных характеристик кристаллографических методами позволило высокой стабильности этих частиц. 2 какие эти отсутствие исследования являются динамические детали нуклеосом как механизм ДНК развертки от гистона ядра; динамичный путь которого необходим для процессов транскрипции и репликации. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 Кроме того, специальные белки, называют ремоделирования факторов было показано для облегчения разборки nucleosomal частиц17; Однако встроенные динамики нуклеосом является критическим фактором в этом процессе, который способствует процессу всей разборки. 14 , 16 , 18 , 19
Одноместный молекула методы, такие как сингл молекула флуоресценции19,20,21, оптических треппинга (пинцет)13,18,,2223 и AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 сыграли важную роль в понимании динамики нуклеосом. Среди этих методов AFM выгоды от нескольких уникальных и привлекательных особенностей. АСМ позволяет визуализировать и характеризуют отдельные нуклеосом, а также более массивы27. От АСМ изображения важные характеристики нуклеосома структуры, такие как длина ДНК, обернутые вокруг гистона ядро может быть измеренной 10,14,,2628; параметр, который является центральным для характеризации нуклеосома распаковки динамики. В прошлом AFM исследования показали нуклеосом высокодинамичных систем и что ДНК может спонтанно развернуть ядро гистона14. Спонтанное разверток ДНК от нуклеосом непосредственно визуализированное AFM, работающих в режиме покадровой, когда изображения делается в водных растворах 14,26,29.
Появление высокоскоростной покадровой инструментария AFM (HS-AFM) сделало возможным для визуализации процесса распаковки нуклеосома миллисекунды шкалы времени 14,15,24. Недавние исследования30 16,HS-AFM центромер конкретных нуклеосом показали несколько новизну нуклеосом, по сравнению с типом канонической. Центромер нуклеосом составляют центромер, небольшая часть критически важное значение для хромосома сегрегации31хромосомы. В отличие от канонических нуклеосом в массовых хроматина гистонов ядро центромер нуклеосом содержит гистона CENP-A вместо гистонов H332,33. В результате этой замены гистон, перенос ДНК в центромер нуклеосом составляет ~ 120 bp вместо ~ 147 bp для канонических нуклеосом; разница, которая может привести к собственный морфологии центромер и канонические нуклеосом массивов34, предполагая, что центромер хроматина проходит выше динамика, по сравнению с навалом, один. Роман динамика, проявленную центромер нуклеосом в HS-AFM16,30 исследования иллюстрируют уникальную возможность непосредственно визуализировать структурных и динамических свойств предоставляемый этот сингл молекула техника нуклеосом. Примеры этих функций будут кратко обсуждены и иллюстрированные в конце документа. Этот прогресс был достигнут благодаря разработке новых протоколов для AFM изображений нуклеосом, а также изменения существующих методов. Цель Протокола, описанные здесь, чтобы этих захватывающих достижений в одной молекулы AFM нуклеосома исследования доступны для всех, кто хотел бы использовать эти методы в своих расследованиях хроматина. Многие из методов, описанных применимы к проблем за изучение нуклеосом и может использоваться для исследования других белков и ДНК систем, представляющих интерес. Несколько примеров таких приложений можно найти в публикации35,36,37,,3839,40,41, 42,,4344,45,46,47,,4849 и перспективы исследований AFM приводятся различные биомолекулярных систем в обзоры29,50,51,,5354.
Протокол, в описанный выше довольно прост и обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, хотя можно отметить несколько важных вопросов. Функционализированных APS-слюда является ключевым субстрат для получения надежных и воспроизводимых результатов. Высокая стабильность APS-слю…
The authors have nothing to disclose.
Автор взносы: ГУС и MSD разработал проект; MSD собрал нуклеосом. MSD и ZS исполнили AFM экспериментов и анализа данных. Все авторы писали и редактировать рукописи.
Plasmid pGEM3Z-601 | Addgene, Cambridge, MA | 26656 | |
PCR Primers | IDT, Coralville, IA | Custom Order | (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3' |
DreamTaq polymerase | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | EP0701 | Catalog number for 200 units |
PCR purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | Catalog number for 50 units |
Tris base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 10708976001 | Catalog number for 250 g |
EDTA | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | 15576028 | Catalog number for 500 g |
(CENP-A/H4)2, recombinant human | EpiCypher, Durham, NC | 16-0010 | Catalog number for 50 ug |
H2A/H2B, recombinant human | EpiCypher, Durham, NC | 15-0311 | Catalog number for 50 ug |
H3 Octamer, recombinant human | EpiCypher, Durham, NC | 16-0001 | Catalog number for 50 ug |
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | 69574 | Catalog number for 10 devices |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9888-500G | Catalog number for 500 mg |
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | Millipore-sigma, Burlington, MO | UFC501008 | Catalog number for 8 devices |
HCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 258148-25ML | Catalog number for 25 mL |
Tricine | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T0377-25G | Catalog number for 25 g |
SDS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 11667289001 | Catalog number for 1 kg |
Ammonium Persulfate (AmmPS) | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610700 | Catalog number for 10 g |
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610158 | Catalog number for 500 mL |
TEMED | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610800 | Catalog number for 5 mL |
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610747 | Catalog number for 10 mL |
2-ME | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M6250-10ML | Catalog number for 10 mL |
ageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | 26616 | Catalog number for 500 uL |
Bio-Safe™ Coomassie Stain | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610786 | Catalog number for 1 L |
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth | TexWipe, Kernersvile, NC | TX604 | |
Muscovite Block Mica | AshevilleMica, Newport News, VA | Grade-1 | |
Aminopropyl silatrane (APS) | Synthesized as described in 22 | ||
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | H4034-25G | Catalog number for 25 g |
Scotch Tape | Scotch-3M, St. Paul, MN | ||
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) | Bruker AFM Probes, Camarillo, CA | ||
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) | Bruker AFM Probes, Camarillo, CA | ||
Aron Alpha Industrial Krazy Glue | Toagosei America, West Jefferson, OH | AA480 | Catalog number for 2 g tube |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M8266-100G | Catalog number for 100 g |
Millex-GP Filter, 0.22 µm | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | SLGP05010 | Catalog number for 10 devices |
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) | Olympus, Japan | ||
Compound FG-3020C-20 | FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan | ||
Compound FS-1010S135-0.5 | FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan | ||
MultiMode Atomic Force Microscope | Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA | ||
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy | Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan |