JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Published: January 31, 2019
doi:
10.3791/58820
, , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til at karakterisere nucleosome partikler på enkelt-molekyle niveau ved hjælp af statisk og time-lapse atomic force mikroskopi (AFM) imaging teknikker. Den beskrevne overflade functionalization metode giver mulighed for opsamling af strukturen og dynamikken i nucleosomes i høj opløsning på nanoplan.

Abstract

Kromatin, som er en lang kæde af nucleosome subunits, er et dynamisk system, der giver mulighed for disse kritiske processer som DNA-replikation og transskription til at tage plads i eukaryote celler. Dynamikken i nucleosomes giver adgang til DNA af replikering og transskription machineries og bidrager kritisk til de molekylære mekanismer bag kromatin funktioner. Enkelt-molekyle studier såsom atomic force mikroskopi (AFM) imaging har bidraget væsentligt til vores nuværende forståelse af rollen, nucleosome struktur og dynamik. Den nuværende protokol beskrives den fremgangsmåde, der giver høj opløsning AFM Billeddannende teknikker til at studere de strukturelle og dynamiske egenskaber af nucleosomes. Protokollen er illustreret af AFM data indhentet for centromer nucleosomes hvor H3 Histon er erstattet med sit modstykke centromer protein en (CENP-A). Protokollen starter med samling af mono-nucleosomes ved hjælp af en kontinuerlig fortynding metode. Forberedelse af glimmer substrat functionalized med aminopropyl silatrane (APS-glimmer), der bruges til nucleosome imaging er kritisk for AFM visualisering af nucleosomes beskrevet og fremgangsmaade at forberede substratet. Nucleosomes deponeret på APS-glimmer overflade er først afbildet ved hjælp af statisk AFM, som indfanger et øjebliksbillede af nucleosome befolkningen. Fra analyser af disse billeder, sådanne parametre som størrelsen af DNA snoet omkring nucleosomes kan måles, og denne proces er også detaljeret. Time-lapse AFM imaging procedure i væsken er beskrevet for højhastighedstog time-lapse AFM, der kan indfange flere billeder af nucleosome dynamics pr. sekund. Endelig, analyse af nucleosome dynamics aktivering kvantitative karakterisering af de dynamiske processer er beskrevet og illustreret.

Introduction

I eukaryote celler er DNA meget komprimeret og organiseret i kromosomer. 1 det første niveau af DNA organisation inden for et kromosom er forsamlingen af nucleosomes i hvilke 147 bp DNA er tæt pakket omkring en Histon octamer kerne. 2 , 3 nucleosome partikler samle på et langt DNA molekyle danner en kromatin array, som er så organiseret indtil en meget kompakt kromosom enhed er dannet. 4 demonteringen af kromatin giver adgang til gratis DNA, der kræves af kritiske cellulære processer såsom gen transskription og genom replikering, tyder på, at kromatin er et meget dynamisk system. 5 , 6 , 7 forståelse de dynamiske egenskaber af DNA på forskellige kromatin niveauer er kritisk vigtigt belyse genetiske processer på det molekylære niveau, hvor fejl kan føre til celledød eller udvikling af sygdomme såsom kræft. 8 en kromatin egenskab af stor betydning er dynamikken i nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 den høje stabilitet af disse partikler har tilladt for en strukturel karakterisering af krystallografiske teknikker. 2 hvad disse undersøgelser mangler er de dynamiske detaljer af nucleosomes såsom mekanismen for DNA udpakning af Histon kerne; den dynamiske pathway der er påkrævet ved processer, transskription og replikering. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 endvidere særlige proteiner kaldes remodeling faktorer har vist sig at lette demonteringen af nucleosomal partikler17; nucleosomes iboende dynamik er imidlertid den afgørende faktor i denne proces, der bidrager til hele demontering proces. 14 , 16 , 18 , 19

Enkelt-molekyle teknikker som enkelt-molekyle fluorescens19,20,21, optisk diffusering (pincet)13,18,22,23 og AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 har været medvirkende til at forstå dynamikken i nucleosomes. Blandt disse metoder, AFM fordele fra flere unikke og attraktive funktioner. AFM gør det muligt at visualisere og karakterisere individuelle nucleosomes samt den længere arrays27. Fra AFM billeder, kan vigtige egenskaber af nucleosome struktur som længden af DNA svøbt omkring Histon kernen være målt 10,14,26,28; en parameter, der er centrale for karakterisering af nucleosome udpakning dynamics. Forbi AFM har undersøgelser afsløret nucleosomes at være stærkt dynamiske systemer og at DNA spontant kan udpakke fra Histon core14. Den spontane udpakning af DNA fra nucleosomes var direkte visualiseret af AFM opererer i tilstanden time-lapse når billeddannelse sker i vandige opløsninger 14,26,29.

Fremkomsten af højhastighedstog time-lapse AFM (HS-AFM) instrumenteringen gjort det muligt at visualisere nucleosome udpakning proces på millisekund tidsskala 14,15,24. Seneste HS-AFM 16,30 undersøgelser af centromer specifikke nucleosomes afslørede flere nye funktioner i nucleosomes sammenlignet med den kanoniske form. Centromer nucleosomes udgør af en centromer, en lille del af den kritisk vigtige til kromosom segregation31kromosom. I modsætning til kanoniske nucleosomes i bulk kromatin indeholder Histon kernen af centromer nucleosomes CENP-A Histon i stedet for Histon H332,33. Som følge af denne Histon substitution, DNA indpakning i centromer nucleosomes er ~ 120 bp i stedet for ~ 147 bp for kanoniske nucleosomes; en forskel, der kan føre til forskellige morfologier centromer og kanoniske nucleosomes arrays34, tyder på, at centromer kromatin gennemgår højere dynamics sammenlignet med størstedelen en. Den nye dynamik vises af centromer nucleosomes i HS-AFM16,30 undersøgelser eksemplificere den enestående lejlighed leveres af denne enkelt-molekyle teknik til direkte visualisere de strukturelle og dynamiske egenskaber af nucleosomes. Eksempler på disse funktioner vil være kort drøftet og illustreret i slutningen af papiret. Dette fremskridt blev gjort på grund af udviklingen af nye protokoller til AFM billeddannelse af nucleosomes samt ændringer af eksisterende metoder. Målet med protokollen beskrevet her er at gøre disse spændende fremskridt i enkelt-molekyle AFM nucleosome undersøgelser tilgængelige for enhver, der ønsker at udnytte disse teknikker i deres kromatin undersøgelser. Mange af de teknikker beskrevet gælder for problemer ud over undersøgelsen af nucleosomes og kan bruges til undersøgelser af andre proteiner og DNA systemer af interesse. Et par eksempler på sådanne programmer kan findes i publikationer35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 og udsigterne til AFM undersøgelser af forskellige Biomolekylær systemer gives i anmeldelser29,50,51,53,54.

Protocol

1. løbende fortynding forsamling af Mono-nucleosomes Generere og rense en ca 400 bp DNA substrat, der indeholder en off-centreret Widom 601 nucleosome positionering sekvens. 55Bemærk: For at begrænse uønskede dannelsen af di-nucleosomes, hver ‘arm’ flankerende positionering rækkefølgen bør ikke overstige ~ 150 bp. Bruge plasmidet pGEM3Z-601 sammen med de designede primere og forstærke substrat DNA ved hjælp af PCR. 423 bp bærematerialet med 122 og 154 bp arm længde…

Representative Results

Mono-nucleosomes blev første gang forberedes til AFM imaging eksperimenter ved hjælp af en kontinuerlig fortynding forsamling metode (figur 1). Rede nucleosomes blev derefter kontrolleres ved hjælp af diskontinuert SDS-PAGE (figur 2). En glimmer overflade var næste functionalized ved hjælp af APS, som indfanger nucleosomes på overfladen samtidig bevare en jævn baggrund for høj opløsning imaging (figur 3). Nucleosomes blev d…

Discussion

Den protokol, der er beskrevet ovenfor er temmelig ligetil og give meget reproducerbare resultater, selv om et par vigtige spørgsmål kan fremhæves. Functionalized APS-glimmer er en nøglen substrat for at få pålidelige og reproducerbare resultater. En høj stabilitet af APS-glimmer er en af de vigtige elementer i dette substrat, der gør det muligt at forberede den billeddiagnostiske substrat i forvejen for brug, der kan bruges i mindst to uger efter at være forberedt. 59 , <sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatter bidrag: YLL og MSD designet projekt; MSD samlet nucleosomes. MSD og ZS udført AFM eksperimenter og data analyser. Alle forfattere skrev og redigeres håndskriftet.

Materials

Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. o. p. h. i. e. E., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. e. e. t. a. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Chellappan, S. P. . Chromatin Protocols. , 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L., Meyers, R. . Encyclopedia of Analytical Chemistry. , 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L., Lyubchenko, Y. L. . Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. , 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. “Antiparallel” DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L., Taatjes, D. J., Roth, J. . Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. , 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T., Braga, P. C., Ricci, D. . Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. , 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. . Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Keywords: Atomic Force MicroscopyNucleosome StructureSingle-molecule ImagingProtein-DNA ComplexesAmyloid AggregatesAlzheimer’s DiseaseParkinson’s DiseaseMica Surface PreparationAPS ModificationStatic AFM Imaging
check_url/58820?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image