Aquí presentamos dos protocolos, uno para medir la tasa de crecimiento específico y la otra para la capacidad de unión a la célula del rotavirus utilizando el ensayo de placa y RT-qPCR. Estos protocolos están disponibles para confirmar las diferencias de fenotipos entre cepas de rotavirus.
El rotavirus es el principal factor etiológico para la diarrea infantil. Es un virus de ARN de doble cadena (ds) y forma una población genéticamente diversa, conocida como quasispecies, debido a su tasa de mutación alta. Aquí, describimos cómo medir la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a la célula del rotavirus como sus fenotipos. Rotavirus es tratado con tripsina para reconocer el receptor de la célula y luego se inocula en cultivo de células MA104. Intermitentemente se recoge el sobrenadante, incluyendo progenie viral. El ensayo de placa se utiliza para confirmar el título del virus (unidad formadora de placa: pfu) de cada sobrenadante recogido. La tasa de crecimiento se estima ajustando datos del tiempo-curso de pfu/mL para el modelo de Gompertz modificado. En el ensayo de unión a la célula, células MA104 en un plato 24-well son infectadas con rotavirus y se incubaron durante 90 minutos a 4 ° C para la adsorción de rotavirus a receptores celulares. Una baja temperatura refrena rotavirus de invadir la célula huésped. Después de lavar para eliminar los viriones, RNA se extrae de viriones que se une a receptores celulares, seguidos por la síntesis de cDNA y PCR cuantitativa de la reverso-transcripción (RT-qPCR). Estos protocolos pueden aplicarse para investigar las diferencias fenotípicas entre cepas virales.
Virus de ARN forman una población genéticamente diversa, conocida como quasispecies1, debido a su tasa de mutación,2 que es más alto que el de los organismos basada en ADN. Estructura de la población en quasispecies es afectada por los factores genéticos de la población, incluyendo la presión de selección, la mutación y la deriva genética. Las cepas dentro de un solo linaje genético pueden mostrar diferentes fenotipos debido a la diversidad genética. Por ejemplo, Rachmadi et al demostró que cloro libre sensibilidad fue diferente entre cepas de norovirus murino que se originaron de una cepa purificada placa S7-PP33.
Rotavirus (rotavirus de género en la familia reoviridae) son virus no-envueltos ds RNA formando quasiespecies2. Además de los factores genéticos de la población descritos, reordenamiento del genoma afecta la diversidad genética de rotavirus porque este virus tiene 11 genomas segmentados4. Rotavirus causan diarrea principalmente entre los neonatos, y las muertes infantiles en el 2013 se estimaron sobre 250.0005. Dos vacunas están en uso en varios países y han sido eficaces en la reducción de la carga de la infección por rotavirus, pero algunos investigadores ahora están discutiendo la presencia de vacuna-escape mutantes6,7,8, 9. la caracterización de estos mutantes es importante comprender los mecanismos de escape de la vacuna.
Aquí, presentamos protocolos para dos ensayos para evaluar la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a la célula del rotavirus para entender las diferencias fenotípicas entre cepas/mutantes. La curva de crecimiento de los rotavirus ha sido presentada en anteriores informes10, pero no se miden usualmente los parámetros de crecimiento tales como la tasa de crecimiento específico. Un ensayo de unión a la célula llevado a cabo anteriormente consiste en la tinción inmunofluorescente de técnica11. Aquí mostramos los métodos más fácil de utilizar el ensayo de placa y RT-qPCR, que permiten analizar cuantitativamente la diferencia de fenotipos virales. Estos métodos son apropiados para la caracterización de fenotipos de rotavirus y finalmente pueden contribuir a la construcción de nuevas vacunas eficaces para varios genotipos.
Nuestro protocolo para la medición de la tasa de crecimiento específico es más fácil que las anteriores y puede ser adaptado para otros virus a menos que no se ha establecido su sistema del cultivo celular. En este estudio, utilizamos el RRV (G3P[3]) porque esta cepa puede formar placas más fácil que los rotavirus humanos al utilizar líneas de células MA104. Algunas cepas de rotavirus humano no pueden formar placa en esta línea celular. Por lo tanto, en lugar del ensayo de placa, el enfoque de formación de unidad (FFU) ensayo15 o mediana cultura tejido dosis infecciosa (TCID50) ensayo puede ser aplicado para muchas de las cepas de rotavirus16. El protocolo presentado para determinar la tasa de crecimiento específico puede ser utilizado para otros tipos de virus pero no es conveniente para el virus para que no se establezca ningún sistema del cultivo celular establecida. Antes de iniciar el experimento para la tasa de crecimiento específico, es mejor saber de antemano cuando el título infeccioso del virus comienza a aumentar y alcanza la fase estacionaria en una prueba preliminar. Si hay demasiadas placas, debe realizarse el ensayo de placa otra vez después de cambiar la tasa de dilución de las muestras de virus. La horas posinfección (hpi) para recoger muestras también son importantes porque la pendiente de la fase de crecimiento exponencial puede ser subestimada si se pierde el momento adecuado para llegar a la fase estacionaria. En la aproximación por el modelo de Gompertz modificado, un coeficiente de determinación siempre ser calculado y comprobado. Si la aptitud para el modelo de Gompertz modificado es baja, otros modelos de crecimiento como el modelo logístico modificado12 pueden ser preferibles.
En la manipulación de las células, al retirar el medio o el virus de inóculo, el PBS para lavado o agarose gel para ensayo de placa debe agregarse puntualmente a cada pozo de una placa de cultivo celular para evitar que las células de la sequedad. Al mismo tiempo, debe verter suavemente PBS o agarosa a células no para extraerla de los pozos. Este paso es el más importante en ambos ensayos (paso 3.9 y 3.11). Si el ensayo de placa tiene demasiadas muestras, se recomiendan subdividir el gel de agarosa (100 mL cada máximo es recomendable) en varias botellas de medio y mantener las botellas calientes hasta justo antes de uso desde agarosa gel se solidifica dentro de unos 10 minutos en la sala de temperatura. Dado que la tripsina es vulnerable a las altas temperaturas17, una solución de tripsina se debe agregar a un medio y la agarosa para el ensayo de placa después de enfriar adecuadamente.
En el ensayo de unión a la célula, la incubación por la Unión del virus a células debe realizarse a 4 º C para evitar la invasión de las células. Según método de Gilling13células son propensas a la sequedad a baja temperatura, por agitación suave es necesario cada 15 min durante la incubación. El kit de extracción de RNA utilizado aquí puede sustituirse por otros equipos. La pendiente de la curva estándar en RT-qPCR debe ser aproximadamente de 3.3 y el coeficiente de determinación debe ser más de 0.98. En comparación con el microscopio de fluorescencia para visualizar la localización del virus en las células, el ensayo es más rápida y más fácil de usar porque no hay Unión de sustancias fluorescentes a los virus.
Recientemente, enteroide intestinal humano (HIE), exhibiendo una similar composición celular y función como epitelio gastrointestinal humano, se ha convertido en disponible para la propagación de rotavirus18. El uso de HIE puede permitirnos evaluar la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a células de cepas no cultivables de rotavirus. También, ambos experimentos descritos aquí podrán aplicarse a la evaluación de los efectos de la droga en ambos fenotipos19. Los protocolos presentados aquí permiten analizar cuantitativamente los cambios en los valores de parámetro de fenotipo de las cepas de rotavirus en variadas condiciones.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el proyecto “El valor cadena: diseño saneamiento sistemas como Eco-comunidad valor sistema de saneamiento”, ResearchInstitute para la humanidad y la naturaleza (RIHN, proyecto No.14200107).
7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui" ![]() |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui" ![]() |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |