2 つのプロトコル、比増殖速度と他のプラクの試金と Rt-qpcr を使用してロタウイルスのセル結合の能力を測定するための 1 つをご紹介します。ロタウイルスの表現型の違いを確認するためは、これらのプロトコルがあります。
ロタウイルスは、小児の下痢の主な病因の要因です。二本鎖 (ds) RNA ウイルスであり、高い突然変異率のための準種として知られている遺伝的に多様な人口を形作る。ここでは、特定の成長率とその表現型としてロタウイルスのセル結合能を測定する方法をについて説明します。ロタウイルスは、細胞受容体を認識するトリプシン処理され、MA104 細胞培養に接種されます。ウイルスの後代を含む上清が断続的に収集されます。ウイルス力価を確認するプラクの試金を使用 (プラーク形成単位: pfu) 各収集清。比増殖速度を推定するには、修正ゴンペルツ モデルに pfu/mL の経時データをフィッティング.セルの結合の試金、24 ウェル プレートの MA104 細胞をロタウイルスに感染して、細胞の受容体へのロタウイルスの吸着のための 4 ° C で 90 分間インキュベートします。低温では、宿主細胞に侵入からのロタウイルスを抑制します。非連結の粒子を削除する洗浄後 RNA は細胞受容体 cDNA 合成と逆のトランスクリプションの量的な PCR (RT qPCR) の順に接続されているから抽出されます。これらのプロトコルは、ウイルス系統間の表現の違いを調査するために適用できます。
RNA ウイルスの突然変異の率、2 DNA ベースの有機体のそれよりも高いため準種1、知られている、遺伝的に多様な人口を形成します。準種の人口構造は、突然変異、淘汰圧、遺伝的浮動など人口の遺伝的要因の影響を受けます。単一の遺伝系統系統は、遺伝的多様性のため異なった表現型を示すかもしれない。たとえば、Rachmadi らは遊離塩素感度がプラーク精製ひずみ S7 PP33から発信されたマウスノロ ウイルス核酸系統間で異なっていたことを示した。
ロタウイルス (レオウイルス科家族でロタウイルス属) は、準種2を形成 ds のエンベロープを持たない RNA ウイルスです。上記人口遺伝的要因に加えては、ゲノム遺伝子再集合は、このウイルスは、11 のセグメント化されたゲノム4ためにロタウイルスの遺伝的多様性を影響します。ロタウイルスは、主に乳児の下痢を引き起こすし、2013 年に乳児の死亡は約 250,0005推定しました。2 つのワクチンでいくつかの国で使用されて、ロタウイルス感染の負荷の低減に効果があったが、一部の研究者はワクチン エスケープ変異体6,7,8,の存在を議論している今9. これらの突然変異体の特性はワクチン エスケープ メカニズムを理解することが重要です。
ここでは、固有の成長率と系統/変異体の間で表現の違いを理解するためにロタウイルスのセル結合能を評価するための 2 つの試金のためのプロトコルを提案する.ロタウイルス感染の成長曲線は、以前レポート10で提示されているが、特定の成長率などの成長パラメーターは通常測定されません。セル結合の試金実施には以前蛍光抗体染色法11が含まれます。定量的表現型ウイルスの違いを話し合うことができるプラクの試金と Rt-qpcr を使用しての簡単な方法を紹介します。これらのメソッドはロタウイルスの表現型の特性のために適切、最終的に複数の遺伝子型の新しいワクチンの建設に貢献するかもしれない。
比増殖速度を測定するためのプロトコルは以前のものよりも簡単に、その細胞培養系が確立されていない限り、その他のウイルスについて、適合できます。本研究で我々 は RRV を使用 (G3P[3]) このひずみことができますを形成するため斑ヒトロタより MA104 細胞株を使用する場合。いくつかの人間のロタウイルスは、この細胞のプラークを形成できません。したがって、プラクの試金ではなくフォーカス ユニット (FFU) アッセイ15または中央組織培養感染量 (TCID50) を形成アッセイを適用できます多くのロタウイルス株16。特定の成長率を求める提案するプロトコルは他のウイルスの種類使用できますが、確立された細胞培養系が確立されていないウイルスには適していません。比増殖速度の実験を開始する前にそれはウイルス感染価が増加を開始すると事前に知っている方は、予備テストで静止した段階に達した。あまりにも多くの斑が存在する場合、ウイルス サンプルの希釈率を変更した後もう一度プラクの試金を実施しなければなりません。サンプルを収集する時間後感染 (hpi) は、静止した段階に到達するための適切な時間ポイントを逃した場合、指数関数的成長段階の斜面が過小評価可能性があるためにも重要です。修正ゴンペルツ モデルによって近似における決定係数常に計算してチェックします。修正ゴンペルツ モデルの適合性が低い場合、変更されたロジスティック ・ モデル12などの他の成長モデルは望ましいかもしれません。
プラクの試金のための洗濯または agarose のゲルのため PBS 中またはウイルスの接種材料を削除するとき、細胞の取扱いにそれぞれに速やかに追加する必要がある乾燥から細胞を防ぐために細胞培養プレートのも。同時に、PBS またはセルに agarose の井戸から外れない優しく注ぐ必要があります。この手順は、両方の試金 (3.9 と 3.11 のステップ) で最も重要です。プラクの試金にあまりにも多くのサンプルがある場合お勧めしますいくつかの培地瓶に agarose のゲル (100 mL 各最大を推奨) を分割して部屋で約 10 分以内 agarose を使用直前にゲルが固化するまでボトルの保温温度。トリプシンは高温17に脆弱であるため、媒体と十分に冷却後プラクの試金のための agarose にトリプシン溶液を追加する必要があります。
セル結合の試金の細胞の侵入を防ぐために 4 ° C で細胞へのウイルスのバインディングの培養を行う必要があります。Gilling の方法13によると細胞がので、穏やかな揺れが必要 15 分毎孵卵中における低温乾燥になりやすい。その他のキットを活用する RNA 抽出キットを置き換えることができます。RT qPCR の標準曲線の傾きは、約 3.3 をする必要があります、決定係数が 0.98 以上にする必要があります。細胞におけるウイルスの局在を可視化する蛍光顕微鏡と比較して、アッセイより迅速かつウイルスへの蛍光物質の結合は必要ないので使いやすい。
最近では、同様の細胞構成と機能を示すひと腸 enteroid (HIE) ひと消化管上皮としてロタウイルスの伝播の18利用可能になりました。日枝の使用が可能となり特定の成長率とロタウイルスの培養株の細胞結合の能力を評価します。また、ここで説明した両方の実験両方の表現型19に対する薬剤の効果の評価に適用できます。ここで紹介するプロトコルは、定量的議論する様々 な条件下でのロタウイルス株の表現型のパラメーターの値を変更することが可能。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、「、衛生値チェーン: 設計衛生システムとして地域の環境値システム」プロジェクト人類と自然 (地球研、プロジェクト No.14200107) のための研究所によって支えられました。
7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui" ![]() |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui" ![]() |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |