मूरीन थाइमस, अग्नाशय Draining लिम्फ नोड और प्लीहा प्रवाह cytometry का उपयोग में नियामक टी सेल सबसेट का निर्धारण
Summary
इस के साथ साथ, हम एक से अधिक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद murine थाइमस, अग्नाशय draining लिम्फ नोड और प्लीहा प्रवाह cytometry का उपयोग कर आगे इन कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग नियामक टी कोशिकाओं के उपसेटों को निर्धारित करने के लिए किया गया था जो फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करते हैं ।
Abstract
हमारे प्रतिरक्षा प्रणाली नियामक टी कोशिकाओं (treg) कोशिकाओं सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक संख्या और विविधता के होते हैं । treg कोशिकाओं को दो सबसेट में बांटा जा सकता है, thymic व्युत्पंन treg (ttreg) कोशिकाओं और पेरीफेली प्रेरित treg (ptreg) कोशिकाओं । वे हमारे शरीर के विभिंन अंगों में मौजूद है और इस तरह के helios और neuropilin 1 के रूप में विशिष्ट मार्कर, द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । यह बताया गया है कि ttreg कोशिकाओं ptreg कोशिकाओं की तुलना में कार्यात्मक रूप से अधिक suppressive हैं. इसलिए, विषम कोशिका आबादी की जांच करते समय दोनों ttreg और ptreg कोशिकाओं के अनुपात का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस के साथ साथ, हम thymic ग्रंथियों, अग्नाशय के draining लिम्फ नोड्स और spleens भारी normoglycemic गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह चूहों से ttreg कोशिकाओं को प्रवाह cytometry का उपयोग कर ptreg कोशिकाओं में भेद एकत्र । हम मैंयुअल रूप से इन अंगों से एकल सेल निलंबन तैयार । fluorochrome संयुग्मित सतह सीडी 4, सीडी 8, CD25, और neuropilin 1 एंटीबॉडी कोशिकाओं को दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया । उन्हें रात भर फ्रिज में रखा गया । अगले दिन, कोशिकाओं को फ्लोरोक्रोम संयुग्मित इंट्राकोशिलर Foxp3 और हेलिओस एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया । इन मार्करों treg कोशिकाओं के दो सबसेट की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करता है एक सरल लेकिन व्यावहारिक तरीके से एक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए मूरीन थाइमस, अग्नाशय draining लिम्फ नोड और प्लीहा और उन्हें बाद में प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए उपयोग.
Introduction
नियामक टी (treg) कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रणाली के homeostasis के लिए महत्वपूर्ण हैं । treg कोशिकाओं की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित कर रहे हैं सतह एंटीजन सीडी 4 और CD25, और प्रतिलेखन कारक forkhead बॉक्स P3 (Foxp3)1,2,3. सकाळगुची एट अल. पहले पता चला है कि CD25 के संवैधानिक रूप से4चूहों, जो मानव treg कोशिकाओं की पहचान के लिए एक अग्रणी अवलोकन प्रदान में टी दमन कोशिकाओं पर व्यक्त किया है । treg कोशिकाओं को प्रतिरक्षा सहिष्णुता में एक केंद्रीय भूमिका निभाते तंत्र की एक किस्म के माध्यम से एक suppressive क्षमता exerting, के माध्यम से cytolysis सहित साइटोलिसिस, एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए, cytolysis उपभोग और cytolysis की अभिव्यक्ति के माध्यम से निषेध टी-लिम्फोसाइट एंटिजेन 45. इसके अतिरिक्त, वे इस तरह के विकास कारक बीटा (tgf-β), interleukin-10 (आईएल-10) और आईएल-३५5बदलने के रूप में निरोधात्मक साइटोकिन्स छिपाना कर सकते हैं । treg कोशिकाओं स्वाभाविक रूप से थाइमस से प्राप्त किया जा सकता है, जो मामले में वे thymus व्युत्पन्न treg (ttreg) कोशिकाओं को नामित कर रहे हैं, या वे उस मामले में परिधीय अंगों में प्रेरित किया जा सकता है कहा जाता है पेरिफेल्ली प्रेरित treg (ptreg) कोशिकाओं.
हेलिओस, ikaros ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर परिवार के एक सदस्य, ttreg कोशिकाओं और ptreg6कोशिकाओं के बीच भेद के लिए एक मार्कर होने की सूचना दी गई थी । बाद में, दो अन्य समूहों की रिपोर्ट है कि neuropilin 1 (Nrp1), एक सेमाफोरिन III रिसेप्टर, कुछ शर्तों के तहत ttreg कोशिकाओं के लिए एक सतह मार्कर के रूप में सेवा कर सकता7,8. फिर भी, सिंह एट अल. पता चला है कि helios भोले चूहों9में इस संदर्भ में एक बेहतर मार्कर है ।
treg कोशिकाओं के सबसेट प्रतिरक्षा प्रणाली के homeostasis के रखरखाव में और autoimmunity और संक्रमण के खिलाफ संरक्षण में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । इसलिए, यह दोनों लिम्फोइड और गैर-लसीकाभ ऊतकों में इन आबादी की संख्या और अनुपात निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसे हासिल करने के लिए, एक को इन अंगों से एकल सेल निलंबन की तैयारी करनी है । पिछले अध्ययनों में कई प्रोटोकॉलों का वर्णन या उपयोग किया गया है । मुख्य रूप से, स्वचालित dissociators पहले प्रकाशित रिपोर्टों10,11में इस्तेमाल किया गया है । स्वचालित dissociators का उपयोग सुविधाजनक और समय की बचत है, लेकिन यह एक महंगी प्रक्रिया है । इसलिए, हम एक मैनुअल विधि का इस्तेमाल किया है एक सेल निलंबन से मूर्तीने thymic ग्रंथियों, अग्नाशई draining लिम्फ नोड्स (pdlns) और normoglycemic गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (मंजूरी) चूहों से spleens भारी तैयार करने के लिए, और इन अंगों से अलग एकल कोशिकाओं । यह विधि हमारे पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है और हमने पाया है कि एकल सेल निलंबन की तैयारी के लिए मैनुअल विधि स्वचालित वियोजन विधि9,12,13,14के रूप में के रूप में कुशल है । इसके अलावा, हम फ्लो cytometry का इस्तेमाल किया सीडी 4 के अनुपात निर्धारित करने के लिए+सीडी 8–CD25+Foxp3+ treg कोशिकाओं और treg कोशिकाओं ttreg और ptreg कोशिकाओं के सबसेट । ttreg और ptreg कोशिकाओं का उपयोग कर प्रतिष्ठित थे helios और Nrp1 के रूप में मार्कर के लिए ttreg सेल. इस प्रकार, हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि एकल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए मैनुअल विधि कुशलता से काम करता है और तैयार एकल सेल निलंबन आगे प्रवाह cytometry का उपयोग कर अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम thymic ग्रंथियों से एकल कोशिकाओं पृथक, pdlns और मंजूरी चूहों की spleens भारी, और की अभिव्यक्ति की जांच की helios और Nrp1 में सीडी 4+सीडी 8–CD25+Foxp3+ treg कोशिकाओं प्रवाह cytometry का उपयोग. वर्तमान अध्ययन म…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्तमान अध्ययन वित्तीय स्वीडिश अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था, exodiab, स्वीडिश मधुमेह फाउंडेशन, स्वीडिश बाल मधुमेह कोष, seb diabetesfonden और o.e. och एडला जोहान्ससंस vetenskapliga stiftelse. लेखकों को भी प्रति धंयवाद-ओला carlsson और स्टेलन sandler उनके समर्थन करता है और चर्चा के लिए करना चाहते हैं ।
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
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