Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry
Summary
Hierin presenteren wij een protocol om te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt aan verdere studie deze cellen met behulp van stroom cytometry. Bovendien, werd dit protocol gebruikt voor het bepalen van de deelverzamelingen van regulatoire T-cellen met behulp van stroom cytometry.
Abstract
Ons immuunsysteem bestaat uit een aantal en de verscheidenheid van immune cellen, met inbegrip van regulatoire T-cellen (Walter) cellen. Treg cellen kunnen worden onderverdeeld in twee subgroepen, serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen en ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen. Ze zijn in verschillende organen van ons lichaam aanwezig en kunnen worden onderscheiden door specifieke markers, zoals Helios en Neuropilin 1. Er werd gemeld dat de tTreg cellen functioneel meer onderdrukkende dan pTreg cellen zijn. Het is daarom belangrijk om te bepalen van het aandeel van zowel tTreg als pTreg cellen, bij het onderzoeken van heterogene cel populaties. Hierin, verzameld wij serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen te onderscheiden van de tTreg cellen van pTreg cellen met behulp van stroom cytometry. Wij kunnen handmatig eencellige schorsingen van deze organen. Fluorescerende geconjugeerd oppervlakte CD4, CD8, CD25 en Neuropilin 1 antilichamen werden gebruikt om de cellen vlek. Ze waren ‘s nachts in de koelkast bewaren. Op de volgende dag waren de cellen gekleurd met fluorescerende geconjugeerd intracellulaire Foxp3 en Helios antilichamen. Deze markeringen werden gebruikt voor het karakteriseren van de twee subsets van Treg cellen. Dit protocol toont een eenvoudige, maar praktische manier voor te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt en ze gebruiken voor latere flow cytometrische analyse.
Introduction
Regulatoire T (Walter) cellen zijn kritisch voor de homeostase van het immuunsysteem. Treg cellen worden gedefinieerd door de uitdrukking van oppervlakte antigenen CD4 en CD25, en de transcriptie factor forkhead vak P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. toonde eerst dat CD25 constitutively op T suppressor cellen in muizen4, die een baanbrekende constatering voor de identificatie van menselijke Treg cellen wordt uitgedrukt. Treg cellen spelen een centrale rol bij immuun tolerantie door uit te oefenen een onderdrukkende mogelijkheid via diverse mechanismen, met inbegrip van cytolysis via de secretie van granzymes voor het opwekken van apoptosis, cytokine consumptie en remming door middel van de expressie van cytotoxische T-lymfocyten antigeen 45. Bovendien kunnen ze remmende cytokines zoals transformeren groeifactor bèta (TGF-β), interleukine-10 (IL-10) en IL-355afscheiden. Treg cellen kunnen natuurlijk worden afgeleid uit de thymus, in welk geval zij serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen zijn aangewezen, of ze kunnen in dat geval heten ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen in het perifere organen worden opgewekt.
Helios, een lid van de familie Ikaros transcriptie factor werd gemeld dat een marker voor onderscheid te maken tussen tTreg cellen en pTreg cellen6. Later, twee andere groepen gemeld dat Neuropilin 1 (Nrp1), een semaphorin III-receptor, als een oppervlak marker voor tTreg cellen onder bepaalde voorwaarden7,8 dienen kan. Toch, Singh et al. is gebleken dat Helios een betere marker in dit verband in naïef muizen9.
De deelverzamelingen van Treg cellen spelen een centrale rol in het behoud van de homeostase van het immuunsysteem en de bescherming tegen autoimmuniteit en infectie. Daarom is het belangrijk om de getallen en verhoudingen van deze populaties in zowel de lymfoïde en de niet-lymfoïde weefsels. Om dit te bereiken, moet een eencellige schorsingen van deze organen voor te bereiden. Een aantal protocollen zijn beschreven of gebruikt in eerdere studies. Automatische dissociators werden vooral gebruikt in eerder gepubliceerde rapporten10,11. Met behulp van de automatische dissociators is handig en tijdbesparend, maar het is een dure procedure. Daarom hebben we een handmatige methode gebruikt om te bereiden eencellige schorsingen van lymfkliertest serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren (PDLNs) en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen (NOD) en geïsoleerde afzonderlijke cellen van deze organen. Deze methode is gebruikt in onze eerdere studies en we vonden dat de handmatige methode voor het opstellen van één celsuspensie zo efficiënt als automatische dissociator methode9,12,13,14 is. Bovendien, we stroom cytometry gebruikt om te bepalen van de verhoudingen van CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellen en de subsets van Treg cellen tTreg en pTreg cellen. De tTreg en pTreg cellen werden onderscheiden met behulp van Helios en Nrp1 als markeringen voor tTreg cel. Zo blijkt uit onze resultaten dat de handmatige methode voor het voorbereiden van de afzonderlijke cellen efficiënt werkt en de schorsingen bereid eencellige verder kunnen worden gebruikt voor studies met stroom cytometry.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie, we geïsoleerd van enkele cellen uit de serie klieren, de PDLNs en de milt van knik muizen, en onderzocht de expressie van Helios en Nrp1 in CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellen met behulp van stroom cytometry. In de huidige studie, werden knik muizen gebruikt, die is een lymfkliertest model van type 1 diabetes. In een eerdere studie, hebben we de wild type muis stammen CD-1 en C57BL/6 muizen gebruikt om te onderzoeken of Helios of Nrp1 een betere marker is voor tTre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De huidige studie werd financieel ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, EXODIAB, de Zweedse Diabetes Foundation, de Zweedse kind Diabetes Fonds, SEB Diabetesfonden en O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Auteurs wil ook bedankt Per-Ola Carlsson en Stellan Sandler voor hun ondersteunt en discussies.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
