Bestämning av regulatoriska T-Cell Subsets i murina tymus, pankreas dränerande lymfkörtel och mjälte med flödescytometri
Summary
Häri, presenterar vi ett protokoll för att förbereda enstaka celler från murina tymus, pankreas dränerande lymfkörtel och mjälte fortsätta att undersöka dessa celler med hjälp av flödescytometri. Dessutom var detta protokoll används för att bestämma delmängder av regulatoriska T-celler med hjälp av flödescytometri.
Abstract
Vårt immunförsvar består av ett antal och mängd immunceller inklusive regulatoriska T-celler (Treg) celler. Treg-celler kan delas in i två undergrupper, thymic härledda Treg (tTreg) och perifert inducerade Treg (pTreg) celler. De finns i olika organ i vår kropp och kan särskiljas genom specifika markörer, såsom Helios och Neuropilin 1. Det har rapporterats att tTreg celler är funktionellt mer repressiv än pTreg celler. Det är därför viktigt att bestämma hur stor andel av både tTreg och pTreg celler när du undersöker heterogena cellpopulationer. Häri, samlat vi thymic körtlar, bukspottskörteln dränerande lymfkörtlar och mjälte från normoglycemic icke-feta diabetiska möss att skilja tTreg celler från pTreg celler med hjälp av flödescytometri. Vi förberett manuellt enda cellsuspensioner från dessa organ. Fluorokrom konjugerat ytan CD4, CD8, CD25, och Neuropilin 1 antikroppar användes för att färga cellerna. De hålls i kylen över natten. Nästa dag var cellerna färgas med fluorokrom konjugerat intracellulära Foxp3 och Helios antikroppar. Dessa markörer har använts för att karakterisera två delmängder av Treg-celler. Detta protokoll visar enkla men praktiska sätt att förbereda enstaka celler från murina tymus, pankreas dränerande lymfkörtel och mjälte och använda dem för efterföljande flöde flödescytometrisk analys.
Introduction
Regulatoriska T (Treg)-celler är kritiska för homeostas av immunsystemet. Treg-celler definieras av uttrycket av ytantigener CD4 CD25 och transkription faktorn forkhead box P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. visade först att CD25 konstitutivt uttrycks på T suppressor celler i möss4, som gav en banbrytande observation för identifiering av mänskliga Treg-celler. Treg-celler spelar en central roll i immuntolerans genom att utöva en suppressiv förmåga via olika mekanismer, inklusive cytolys genom utsöndring av granzymes att inducera apoptos, cytokin konsumtion och hämning genom uttrycket av cytotoxiska T-lymfocyter antigen 45. Dessutom kan de utsöndra inhibitoriska cytokiner såsom omvandla tillväxt factor-beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) och IL-355. Treg-celler kan naturligtvis härledas från tymus, i vilket fall de designeras thymic härledda Treg (tTreg)-celler, eller de kan induceras i perifera organ i detta fall kallas perifert inducerade Treg (pTreg) celler.
Helios, en medlem av familjen Ikaros transkription faktorn, rapporterades vara en markör för att skilja mellan tTreg celler och pTreg celler6. Två andra grupper rapporterade senare, att Neuropilin 1 (Nrp1), en semaphorin III-receptorn, kan tjäna som en surface markör för tTreg celler under vissa villkor7,8. Singh et al. har dock visat att Helios är en bättre markör i detta sammanhang i naiva möss9.
Delmängder av Treg-celler spelar en nyckelroll i att upprätthålla homeostas av immunsystemet och i skydd mot autoimmunitet och infektion. Det är därför viktigt att fastställa antal och proportioner av dessa populationer i både lymfoida och icke-lymfoida vävnader. För att uppnå detta, måste man förbereda enda cellsuspensioner från dessa organ. Ett antal protokoll har beskrivit eller används i tidigare studier. Främst, har automatiska dissociators använts i tidigare publicerade rapporter10,11. Använda automatisk dissociators är bekvämt och tidsbesparande, men det är ett dyrt förfarande. Därför har vi använt en manuell metod för att förbereda enda cellsuspensioner från murina thymic körtlar, bukspottskörteln dränerande lymfkörtlar (PDLNs) och mjälte från normoglycemic icke-feta diabetiker (nicka) möss och isolerade enstaka celler från dessa organ. Denna metod har använts i våra tidigare studier och vi fann att den manuella metoden för att förbereda enda cellsuspension är lika effektiva som automatisk dissociator metod9,12,13,14. Dessutom använde vi flödescytometri för att bestämma andelen CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg-celler och delmängder av Treg-celler tTreg och pTreg celler. TTreg och pTreg celler var distingerade med Helios och Nrp1 som markörer för tTreg cell. Våra resultat tyder således, att den manuella metoden för att förbereda de enda cellerna fungerar effektivt och de beredda enda cellsuspensioner kan användas vidare för studier med hjälp av flödescytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie vi isolerade enstaka celler från thymic körtlar, PDLNs och mjälte nicka möss, och undersökt uttrycket av Helios och Nrp1 i CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg-celler med hjälp av flödescytometri. I den aktuella studien användes nicka möss, som är en murin modell av typ 1-diabetes. I en tidigare studie har vi använt vildtyp mus stammar CD-1 och C57BL/6 möss för att undersöka om Helios eller Nrp1 är en bättre markör för att skilja tTreg celler från pTreg …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Föreliggande studie stöddes ekonomiskt av Vetenskapsrådet, EXODIAB, Diabetes stiftelsen, svenska barn Diabetes fonden, SEB Diabetesfonden och O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Författarna vill även tack Per-Ola Carlsson och Stellan Sandler för deras stöd och diskussioner.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
