تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات النيكوتين أستيل (ناتشرس) في الماوس شرائح الدماغ بالنيكوتين أونكاجينج. أونكاجينج النيكوتين عندما يقترن مع تسجيل التصحيح المتزامن المشبك والليزر 2-فوتون الفحص المجهري، يربط وظيفة مستقبلات النيكوتين مع مورفولوجيا الخلوية، توفير فهم أعمق لعلم الأعصاب اتروبين.
أستيل (ACh) يعمل من خلال المستقبلات تعدل مجموعة متنوعة من العمليات العصبية، ولكنه قد تم تحديا لربط وظيفة مستقبلات ACh مع موقع سوبسيلولار داخل الخلايا حيث يتم تنفيذ هذه الوظيفة. لدراسة سوبسيلولار موقع مستقبلات ACh النيكوتين (ناتشرس) في أنسجة الدماغ الأصلية، وضعت أسلوب بصري للإفراج عن دقة النيكوتين في مواقع منفصلة بالقرب من أغشية الخلايا العصبية خلال التسجيلات الكهربية. فرضت التصحيح الخلايا العصبية في الدماغ شرائح مليئة بصبغ إلى تصور عن مورفولوجيا أثناء الليزر 2-فوتون الفحص المجهري، والنيكوتين أونكاجينج يتم تنفيذها مع فلاش خفيفة بتركيز شعاع ليزر نانومتر 405 قرب الأغشية الخلوية واحد أو أكثر. يتم قياس الانحرافات الحالية الخلوية، وصورة عالية الدقة ثلاثية الأبعاد (3D) من الخلايا العصبية المسجلة للسماح لمصالحة ردود ناشر مع مورفولوجيا الخلوية. يسمح هذا الأسلوب لتحليل مفصل لناشر التوزيع الوظيفي في الاستعدادات الأنسجة المعقدة، واعدة لتعزيز فهم اتروبين كبيرة.
إشارات اتروبين ينظم العديد من عمليات الدماغ، بما في ذلك مراقبة أتينشونال وحركة مداركه، ومكافأة1،2. المخدرات التي تعزز انتقال أستيل (ACh) تستخدم لعلاج ضعف الإدراك المرتبطة بمرض الزهايمر، مما يعني ضمناً بدور هام لأنظمة اتروبين في الإدراك3. يمكن أن يؤدي تحسين فهم المستقبلات اتروبين والدوائر في الدول السليمة والمريضة إلى أفضل النهج العلاجي للعديد من الأمراض/الاضطرابات العصبية.
مستقبلات ACh النيكوتين (ناتشرس) هي عائلة من بوابات يجند أيون قنوات تدفق الاتصالات استجابة لمنظمة العمل ضد الجوع الذاتية أو الخارجية النيكوتين من منتجات التبغ. نظراً لأنهم كانوا من بين مستقبلات الناقل العصبي جداً الأولى أن يكون وصف4، ناشر علم الصيدلة والموقع في ألياف العضلات مفهومة جيدا لمستقبلات العضلات من نوع. وفي المقابل، نسبيا لا يعرف الكثير عن علم الصيدلة وتوزيع سوبسيلولار ناتشرس الأصلية في الدماغ. وتناول هذه الفجوة في المعرفة مؤخرا وضع تحقيق كيميائية رواية التي تسمح للتنشيط السريع وتقييد مكانياً من ناتشرس في أنسجة المخ أثناء التصوير بالهاتف الخلوي وتسجيل الكهربية5. هنا، يتم وصف الخطوات المنهجية الرئيسية التي تشارك في هذا النهج، مع الهدف العام المتمثل في تعزيز القدرة على الاتصال الدالة ناشر مع هيكل الخلايا العصبية.
فوتواكتيفاتابل النيكوتين (Nic السلطة الفلسطينية؛ واسم المادة الكيميائية: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-الأمينية] الكومارين-4-يل] الميثيل-النيكوتين) يمكن أن تكون فوتوليزيد مع ~ 405 نانومتر ومضات الليزر بكفاءة الإفراج عن النيكوتين5،6. قبل أونكاجينج، مستقرة في حل السلطة الفلسطينية-Nic والمعارض أي الميزات الدوائية أو الكيميائية الضوئية غير مرغوب فيه5. بعد التحلل الضوئي، ينشط النيكوتين المفرج عنهم كما هو متوقع ناتشرس ومشتقات أونكاجينج عقاقيري الخاملة5. يتم استخدام ليزر كونتينووسوافي كمصدر الضوء التحلل الضوئي مع قوة إخراج > 1 ميغاواط تقاس في العينة. عند المترجمة، تحفيز الصورة المستهدفة هو جنبا إلى جنب مع القدرة على تحديد موقع الأغشية الخلوية مع الليزر 2-فوتون الفحص المجهري (2PLSM)، واثنين من المزايا الرئيسية لهذا النهج هي الأكمل: سرعة التحلل الضوئي والدقة المكانية.
في معظم النواحي، التحلل الضوئي للسلطة الفلسطينية-Nic متفوقة على وسائل أخرى لإيصال يغاندس ناتشر المستقبلات داخل شرائح المخ. وتشمل هذه النهج حمام التطبيق7 والمخدرات المحلية التسليم عن طريق البخاخ ماصة8. بينما النهج السابق الذي يميل إلى المبالغة التأكيد على الآثار الطويلة الأجل للعقاقير التطبيقية، يمكن أن تعاني هذا النهج الأخير من تقلب في استجابة حركية بين المحاكمات وعبر الخلايا. أيا من هذه النهج البديلة يمكن التمييز على نحو كاف مستقبلات الأنشطة في مختلف المواقع الخلوية من العصبية نفسها. الإفراج عن أوبتوجينيتيكالي المنشط لمنظمة العمل ضد الجوع وقد استخدمت للتحقيق في ناتشرس الأصلية9،،من1011، ولكن لم تثبت ذلك مفيدة لرسم خرائط مواقع ناشر سوبسيلولار. وعلاوة على ذلك، اعتمدت معظم الدراسات استخدام هذا النهج على ماوس بكتيرية صبغي اصطناعي المعدلة وراثيا معربا عن ChR2 مع انتقال اتروبين الشاذ12،،من1314، 15 , 16 , 17.
السلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي غير النهج البصرية فقط لدراسة مستقبلات اتروبين. كارباتشول محبوس كان يستخدم لتعيين وظيفيا أنشطة مستقبلات ACh في الخلايا المستزرعة18 والدماغ شرائح19، ولكن لم تكن متاحة تجارياً للدراسات المقارنة أثناء تطوير السلطة الفلسطينية-nic. أ مكررا الروثينيوم (بيبيريديني)–أبلغ النيكوتين معقدة (روبي-النيكوتين) للسماح للنيكوتين أونكاجينج20، لكن التحضيرات التجارية روبي-النيكوتين أثبتت أنها أقل شأنا من السلطة الفلسطينية-Nic في مقارنة وجها لوجه دراسة5. قد يكون من المفيد تكرار مثل هذه التجارب المقارنة غير تجاري، الغاية تنقية روبي-النيكوتين، كما يمكن استيعابه مرئية مجاملة الميزات السلطة الفلسطينية-Nic للدراسات اتروبين. وأخيراً، nAChRs قد أيضا بصريا تحريف باستخدام مزيج من يغاندس صور التحويل ومستقبلات وراثيا21. وهذا النهج مكمل للسلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي في أنسجة المخ، مع القدرة/شرط الوراثية استهداف ناشر المعدلة التي ينظر إليها على أنها ميزة وعيب.
وينبغي ملاحظة العديد من المتطلبات الأساسية لهذا النهج. أولاً، يلزم أسلوب تصور مناسب لتحديد بدقة في غشاء الخلايا العصبية. تصوير مع الفحص المجهري التقليدي برنامج التحصين الموسع-الأسفار قد تكون كافية عند دراسة الخلايا المستزرعة، ولكن لتسجيل من الخلايا العصبية في الدماغ شرائح أو أنسجة سميكة الاستعدادات الأخرى، 2PLSM أو مجهرية [كنفوكل] شرط. ثانيا، مطلوب طريقة مناسبة لوضع شعاع الليزر التحلل الضوئي. ويستخدم هذا النهج رأس المزدوج-جلفانومتر المسح الضوئي مع اثنين من المرايا المستقلة س ص للمسح الضوئي النقطية التصوير شعاع ونقطة فوتواكتيفيشن باستخدام أونكاجينج الليزر شعاع22،،من2324. حلول محدودة أخرى، أكثر من الممكن، مثل (1) رأس واحد-جلفانومتر مسح أن يمسح النقطية بدلاً من ذلك التصوير شعاع وشعاع أونكاجينج، أو (2) ببساطة توجيه الحزم أونكاجينج إلى مركز مجال الرؤية مثل أن يوجه الخلية هذا الموقف للتحلل الضوئي فلاش. ثالثا، نظام مطلوب لتسجيل الكهربية المتزامنة إذا كان أحد يرغب في جمع الإشارات الفسيولوجية أثناء التجارب. يمكن تلبية الاحتياجات المذكورة أعلاه مع تقنية تصوير ضوئية-كل مناسبة، كما وصفت ذلك مؤخرا5. ويرد أدناه، بروتوكول مفصلة تصف الخطوات الرئيسية لهذا النهج.
اختيار أسلوب التطبيق/تسليم السلطة الفلسطينية-Nic هو الخطوة الأكثر أهمية في هذه التقنية المترجمة صور-التحفيز. أسلوبي، وتطبيق حمام ونضح المحلية، كل تقدم مزايا متميزة والقيود. الاختيار إلى حد كبير يتأثر مستوى التعبير الفنية ناتشر في الخلية نوع من الفائدة. أنها غالباً ما يفضل استخدام حمام التطبيق عندما تكون مستويات التعبير الفنية العالية، كما يسمح التطبيق حمام لتركيز تحقيق موحدة المحيطة بالخلية مسجل، تيسير تفسير البيانات. تطبيق حمام أيضا يلغي الحاجة إلى ماصة نضح ثانية في الأنسجة، مما يجعل من الأسهل العملية برمتها. ومع ذلك، المركبات تطبيق حمام مكلفة التكاليف أكثر كل تجربة.
عادة، استكشاف الأخطاء وإصلاحها ينطوي على محاولة لفهم لماذا هو تنشيط ناشر لا ينظر التحلل فلاش التالية. عند العمل مع نوع خلية التي لم تدرس سابقا مع السلطة الفلسطينية-Nic، المحقق ينبغي أداء التطبيق نفخة المحلي لمنظمة العمل ضد الجوع أو النيكوتين تحديد ما إذا كانت مستقبلات كافية وظيفيا عن5. وينبغي أن يتم للتحقق من أن النظام قادر على الكشف عن استجابات التحلل الضوئي، تجارب التحكم في الخلايا العصبية هابينولا الآنسي التي تعبر عن كميات كبيرة من مستقبلات30. في هذا المجال الدماغ، والسلطة الفلسطينية-Nic حمام التطبيق الممكن، وهو الأفضل لإجراء التجارب على التحقق من صحة. إلا بعد إجراء هذه التجارب التحقق من الصحة يجب أن واحد الانتقال إلى نوع خلية تدرس. إذا كان قد تم التحقق من صحة النظام التجريبي والردود تبقى صغيرة جداً أو غير قابلة للكشف، فإنه قد يكون هناك مبرر لزيادة تركيز السلطة الفلسطينية-Nic، وزيادة كثافة فلاش أو مدة النبضة، إضافة المغير ناشر اللوستيريك إيجابية لتعزيز ناشر النشاط6، أو مزيج من هذه.
في بعض الأحيان، الردود أونكاجينج كبيرة جداً، مع تنشيط ناشر كبير أدى إلى الجهد غير المباشرة بوابات نا+ قناة التنشيط والتيارات إلى الداخل أونكلامبيد سبب المشبك الفضاء الفقراء. يمكن القضاء على هذه التحف التي تماما تحجب التيارات ناشر إلى الداخل واستحالة تفسير البيانات، بإدراج QX-314 (2 مم) في ماصة التسجيل. قد أيضا القضاء بالحد من تركيز السلطة الفلسطينية-Nic أو بتخفيض كثافة فلاش أو مدة النبضة. في جميع التجارب التي صور الضوء المرئي-التحفيز، يجب توخي الحذر عند اختيار مواقع التحفيز لتجنب التحفيز/التحلل غير مقصودة لأعلى أو أسفل المستوى البؤري المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، وعندما ينطبق، قوة الليزر يجب دائماً أن تيتراتيد استخراج الاستجابات الفسيولوجية. من المهم خصوصا أن تكون على علم فوتوستيموليشن محور ع عند العمل مع يغاندس محبوس، يغاندس التي يتم تنشيطها أعلى/أسفل بقعة التنسيق قد لا يزال منتشر والتفاعل مع النظام البيولوجي (أي مستقبلات، ) في إطار الدراسة.
السلطة الفلسطينية-Nic الليزر فلاش التحلل الضوئي قد لا تكون مناسبة لجميع المحققين، كما توجد قيود عديدة. الأول هو التكلفة العالية نسبيا لهيكل مناسب. عند العمل مع شرائح المخ سليمة، أونكاجينج قرب الهياكل الصغيرة-قطر مثل dendrites يتطلب نظام تصور متطورة مثل مجهر 2-فوتون. وبصرف النظر عن التكلفة العالية Ti:sapphire، الانضباطي الليزر نبضات الأشعة تحت الحمراء للمنفذ 2-فوتون مجهرية، نظام مزدوج-جلفانومتر قادر على المواقع بشكل مستقل اثنين من أشعة الليزر كذلك يزيد من تكلفة النظام. يمكن تخفيض تكاليف النظام الكلي باستخدام نظام الصنع إذا كان المحقق لديه ما يكفي من الخبرة والوقت لبناء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، والمحافظة على هذا نظام. القيد ثاني غالباً ما ينطوي على التعبير الفنية ناشر منخفضة، مما يمكن التخفيف جزئيا عن طريق اتخاذ الخطوات كما هو مذكور أعلاه، ولكن هذا قد لا تضمن النجاح. عادة، إذا كان أحد لا يمكن قياس التيارات يجند تفعيلها بعد نفخة-تطبيق يضع، السلطة الفلسطينية-Nic فلاش التحلل تحت المشبك الجهد قد لا تعطي نتائج مقبولة. القيد ثالث ينطوي الجوهرية الأسفار للسلطة الفلسطينية-Nic nic. السلطة الفلسطينية تمتص الضوء ~ 405 نانومتر وتنبعث في مجموعة مماثلة كالبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) أو أليكسا 4885. عندما تتجاوز تركيزات السلطة الفلسطينية-Nic ~ 1 مم، هذه الخاصية الأسفار يمكن جعلها صعبة في نفس الوقت تصور الهياكل العصبية. للتخفيف من هذا، المهم أن تكون قادرة على السيطرة على تدفق السلطة الفلسطينية-Nic من ماصة التروية بسهولة. بشكل دوري، أوقف تدفق السلطة الفلسطينية-Nic للسماح لجزيئات الفلورسنت لنزع فتيل بعيداً. وهذا يسمح بإعادة التصوير من العصبية للتحقق من موقف بقعة من شعاع أونكاجينج. القيد الرابع محتملة أن أذكر ينطوي على استخدام 405 نانومتر الضوء للتحلل الضوئي. أطوال موجية أقصر مثل 405 نانومتر أكثر عرضه للتشتت في الأنسجة المعقدة مثل شريحة الدماغ. وهكذا، في كثافة فلاش معين والمدة، أونكاجينج استجابة ستريك وحركية تسوس قد الأثران تتأثر بعمق التركيز أونكاجينج داخل الشريحة. استنتاجات بشأن الجوانب البيولوجية nAChRs ينبغي أن تراعي هذا تحذير هام.
واستخدمت هذه التقنية فلاش التحلل الضوئي الليزر مترجمة مؤخرا للكشف عن تفاصيل جديدة حول ناشر علم الأعصاب. على سبيل المثال، يعزز التعرض المزمن النيكوتين بيريسوماتيك والدالة ناتشر الجذعية في الخلايا العصبية هابينولا الآنسي5. كما كان يستخدم للمساعدة في توضيح، للمرة الأولى، أن منطقة تيجمينتال البطني غلوتامات الخلايا العصبية تعبر عن ناتشرس الوظيفية في بيريسوماتيك ومقصورات الخلايا الجذعية6. وهناك العديد من إمكانات المستقبل يستخدم هذا الأسلوب والنهج الذي يمكن أن تطبق على أنواع العصبية الرئيسية الأخرى أن من المعروف أن ناتشرس صريحة، مثل الخلايا العصبية الهرمية القشرية31 أو إينتيرنيورونس في قشرة الدماغ32، المخطط33 ، وقرن آمون19. يمكن أيضا الجمع بين هذه التقنية الجينات الصيدلة و/أو ناتشر تحرير34 ترجمة مستقبلات محددة الأنواع الفرعية للأقسام العصبية المختلفة. هذا النهج يمكن تكييفها بسهولة للمركبات الأخرى قفص الكومارين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تلك التي وضعت بالتوازي مع السلطة الفلسطينية-Nic5. أخيرا، السلطة الفلسطينية-Nic فلاش التحلل يوم ستستخدم في حيوان مستيقظا يتصرف لدراسة العمل للنيكوتين في نماذج الرواية الصيدلة السلوكية.
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون أعضاء المختبر من المحققين الرئيسيين شمال غرب التالية: درينان ريان، دال جيمس سورمير، يفجينيا كوزوروفيتسكيي، وأنيس المقاول. بتأييد هذا العمل لنا الوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) (منح DA035942 و DA040626 إلى R.M.D.)، ومؤسسة PhRMA (زمالة M.C.A.)، و HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |