Cet article présente une méthode pour l’étude des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (Nachr) dans des coupes de cerveau de souris par la nicotine uncaging. Lorsqu’il est couplé avec enregistrement de simultanée patch clamp et 2 photons laser, microscopie à balayage, la nicotine uncaging relie fonction des récepteurs nicotiniques avec une morphologie cellulaire, offrant une meilleure compréhension de la neurobiologie cholinergique.
L’acétylcholine (ACh) agit par l’intermédiaire de récepteurs pour moduler une variété de processus neuronaux, mais il a été difficile de lier la fonction des récepteurs ACh avec localisation subcellulaire dans les cellules où cette fonction est exercée. Afin d’étudier l’emplacement subcellulaire des récepteurs nicotiniques de ACh (Nachr) dans le tissu cérébral native, une méthode optique a été développée pour libération précise de nicotine à des endroits discrets près de membranes neuronales pendant les enregistrements électrophysiologiques. Patch clamp de neurones dans le cerveau sont remplis de tranches de teinture de visualiser leur morphologie en microscopie à balayage laser 2 photons, et la nicotine uncaging est exécutée avec un flash de lumière en focalisant un faisceau de laser 405 nm près d’une ou plusieurs membranes cellulaires. Déflexions actuelles cellulaires sont mesurées, et une image haute résolution de (3D) en trois dimensions du neurone enregistré est faite pour permettre la réconciliation des réponses de la CNCDH dont la morphologie cellulaire. Cette méthode permet une analyse détaillée de la CNCDH distribution fonctionnelle dans les préparations de tissu complexe, promettant d’améliorer la compréhension de la neurotransmission cholinergique.
Signalisation cholinergiques module nombreux processus cérébraux, y compris le contrôle attentionnel, mouvement volontaire et récompense1,2. Les médicaments qui améliorent la transmission de l’acétylcholine (ACh) sont utilisés pour traiter des troubles cognitifs associés à la maladie d’Alzheimer, ce qui implique un rôle important pour des systèmes cholinergiques dans la cognition3. Une meilleure compréhension des récepteurs cholinergiques et circuits dans les États sains et malades pourrait conduire à meilleures approches thérapeutiques pour plusieurs maladies/troubles neurologiques.
Récepteurs nicotiniques de ACh (Nachr) sont une famille de canaux ioniques ligand-dépendants qui en réponse à l’ACh endogène ou exogène nicotine du tabac, les cations de flux. Compte tenu du fait qu’ils étaient parmi les premiers récepteurs neurotransmetteur décrit4, la CNCDH pharmacologie et l’emplacement dans les fibres musculaires sont bien comprises pour les récepteurs de type musculaire. En revanche, relativement peu est connu sur la pharmacologie et de la distribution subcellulaire des Nachr native dans le cerveau. Cette lacune dans la connaissance a été récemment adressée en développant une nouvelle sonde chimique qui permet pour l’activation rapide et dans l’espace restreinte de Nachr dans le tissu cérébral durant l’imagerie cellulaire et enregistrement électrophysiologique5. Ici, les principales étapes méthodologiques impliqués dans cette démarche sont décrits, dans le but d’accroître la capacité de connecter la CNCDH fonction avec structure neuronale.
La nicotine Photoactivatable (PA-Nic ; nom chimique : 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] coumarine-4-yl] méthyl-nicotine) peuvent être photolysés avec ~ 405 nm laser clignote pour libérer efficacement la nicotine5,6. Avant uncaging, PA-Nic est stable en solution et montre aucune fâcheuse caractéristiques pharmacologiques ou photochimique5. Après la photolyse, libéré de la nicotine active prévisible Nachr et les sous-produits de libération sont pharmacologiquement inerte5. Un laser à onde continue est utilisé comme source lumineuse photolyse avec une puissance > 1 mW mesurée dans l’échantillon. Si localisés, photo-stimulation ciblée est combinée avec la possibilité de localiser les membranes cellulaires avec 2 photons microscopie à balayage laser (2PLSM), et les deux principaux avantages de cette approche sont pleinement réalisés : photolyse vitesse et précision spatiale.
À bien des égards, la photolyse du PA-Nic est supérieure aux autres méthodes de prestation CNCDH ligands récepteurs dans les tranches de cerveau. Ces approches comprennent bain demande7 et drogue local livraison via une pipette de puffer8. Alors que l’ancienne approche tend à trop insister sur les effets à long terme du médicament appliqué, cette dernière approche peut souffrir de variabilité de la cinétique de la réaction entre les essais et dans les cellules. Aucune de ces approches peut bien distinguer activités récepteur dans différents endroits cellulaires du même neurone. Optogenetically-activé la libération d’ACh a été utilisée pour enquête de native Nachr9,10,11, mais il n’a pas prouvé utile pour des emplacements de subcellulaire CNCDH cartographie. En outre, la plupart des études utilisant cette approche sont sont appuyés sur une souris transgénique exprimant le ChR2 chromosome artificiel bactérien avec transmission cholinergique anormal12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic photolyse n’est pas l’approche seulement optique pour l’étude des récepteurs cholinergiques. Une “cage” carbachol a été utilisé pour mapper fonctionnellement ACh activités de récepteurs dans les cellules cultivées tranches de cerveau et18 19, mais n’était pas disponible dans le commerce pour les études comparatives pendant l’élaboration du PA-nic. Un bis de ruthénium (bipyridine)-complexe de la nicotine (RuBi-nicotine) a été signalée pour permettre la nicotine libération20, mais les préparations commerciales de RuBi-nicotine s’est avérée inférieure à PA-Nic dans une comparaison entre étudient5. Il peut être utile de répéter de telles expériences comparatives avec non-commerciale, hautement purifiée RuBi-nicotine, que son absorption dans le visible pourrait compléter caractéristiques de PA-Nic pour études cholinergiques. Enfin, Nachr ont également été optiquement manipulé à l’aide d’une combinaison des ligands photo-commutable et récepteurs génétiquement modifiés21. Cette approche est complémentaire à la photolyse de PA-Nic dans le tissu cérébral, avec la capacité/besoin de ciblage génétique de la CNCDH mis à jour le vue comme un avantage et un inconvénient.
A noter plusieurs exigences clés de cette approche. Tout d’abord, une méthode de visualisation approprié est nécessaire pour localiser avec précision la membrane neuronale. Imagerie en microscopie conventionnelle épifluorescente peut-être suffire lorsque l’on étudie les cellules cultivées, mais pour l’enregistrement de neurones dans des tranches de cerveau ou d’autres préparations de tissus épais, 2PLSM ou microscopie confocale est une exigence. En second lieu, une méthode appropriée est nécessaire pour positionner le faisceau laser de photolyse. Cette approche utilise une tête double-galvanomètre scan avec deux miroirs indépendants x-y pour raster balayage du faisceau d’imagerie et photoactivation de point en utilisant la libération laser faisceau22,23,24. Autres solutions plus limitées sont possibles, tels que (1) une tête de balayage unique-galvanomètre qu’alternativement raster scanne le faisceau d’imagerie et le faisceau de libération ou (2) tout simplement diriger le faisceau vers le centre du champ de vision de libération telle que la cellule est amenée à cette position pour la photolyse éclair. En troisième lieu, un système est nécessaire pour l’enregistrement électrophysiologique simultanée si l’on veut recueillir les signaux physiologiques au cours d’expériences. Les prescriptions ci-dessus peuvent être satisfaites avec une technique d’imagerie optique adaptée, comme l’a récemment décrit5. Ci-dessous, un protocole détaillé est inclus qui décrit les étapes clés de cette approche.
Le choix de la méthode d’application/livraison PA-Nic est l’étape la plus critique avec cette technique de photo-stimulation localisée. Les deux méthodes, la demande de bain et la perfusion locale, chacune offre des limitations et des avantages distincts. Le choix est largement affecté par le niveau d’expression fonctionnelle CNCDH dans le type de cellules d’intérêt. Il est souvent préférable d’utiliser l’application bain lorsque les niveaux d’expression fonctionnelle sont élevés, comme application de bain permet une concentration uniforme sonde entourant la cellule enregistrée, facilitant l’interprétation des données. Application de bain élimine également le besoin d’une deuxième pipette de perfusion dans les tissus, faciliter l’ensemble du processus. Toutefois, l’application bain de cher composés coûtera plus cher par expérience.
Communément, dépannage consiste à essayer de comprendre pourquoi aucune activation de la CNCDH n’est vu la photolyse éclair suivante. Lorsque vous travaillez avec un type de cellule qui n’a pas été étudié précédemment avec PA-Nic, l’enquêteur doit exécuter puff-application locale d’acétylcholine ou la nicotine pour déterminer si les récepteurs suffisantes sont fonctionnellement exprimé5. Pour valider que le système est capable de détecter les réponses de la photolyse, expériences de contrôle doit être effectuées dans les neurones habenula médial qui expriment des grandes quantités de récepteurs30. Dans cette région du cerveau, application de bain PA-Nic est possible, ce qui est préférable pour des expériences de validation. Seulement après l’exécution de ces expériences de validation doit on passer à un type de cellules peu étudiée. Si le système expérimental a été validé et réponses restent très petites ou indétectable, il peut être justifié d’augmenter la concentration de PA-Nic, augmenter l’intensité du flash ou la durée de l’impulsion, ajouter un modulateur allostériques positifs CNCDH pour améliorer la CNCDH activité6, ou une combinaison de ceux-ci.
Occasionnellement, libération de réponses sont trop grandes, avec activation de la CNCDH significative résultant en tension indirecte gated Na+ canal activation et debloquées courants entrants en raison de la pince espace pauvre. Ces artefacts, qui complètement occulter la CNCDH courants entrants et rendent l’interprétation des données, peuvent être éliminés par l’inclusion de QX-314 (2 mM) dans la pipette de l’enregistrement. Ils peuvent également être éliminés en réduisant la concentration de PA-Nic ou en réduisant l’intensité du flash ou la durée de l’impulsion. Dans toutes les expériences de stimulation-photo lumière visible, doit être attentif lors du choix des sites de stimulation afin d’éviter les imprévus stimulation/photolyse au-dessus ou au-dessous du plan focal désiré. De plus et quand il y a lieu, la puissance du laser doit toujours être titrée afin de reproduire les réactions physiologiques. Il est particulièrement important d’être conscient de l’axe z photostimulation lorsque vous travaillez avec des ligands en cage, comme ligands qui sont activés au-dessus/en dessous le foyer peuvent encore diffus et interagir avec le système biologique (c.-à-d. les récepteurs, ) à l’étude.
La photolyse éclair laser PA-Nic peut ne pas convenir pour tous les enquêteurs, comme plusieurs limitations existent. Le premier est le coût relativement élevé d’une installation convenable. Lorsque vous travaillez avec des tranches de cerveau intact, uncaging près de structures de faible diamètre, comme dendrites nécessite un système de visualisation sophistiquées comme un microscope 2 photons. Mis à part le coût élevé d’un TI : Sapphire, tunable laser pulsé de l’IR pour la microscopie 2 photons performante, un système de double-galvanomètre capable de deux faisceaux laser de positionnement indépendamment plus augmente les coûts de système. Les coûts du système total peuvent être réduites en utilisant un système de construction artisanale si l’enquêteur a suffisamment expertise et le temps de construire, de dépanner et maintenir un tel système. Une autre limite souvent implique l’expression fonctionnelle CNCDH faible, qui peut être partiellement atténuée par la démarche comme mentionné ci-dessus, mais cela ne peut pas garantir le succès. En général, si on ne peut pas mesurer les courants de ligand-activé après puff-application d’agonistes, photolyse éclair PA-Nic sous bride de tension ne peuvent pas donner des résultats acceptables. Une troisième limite implique l’intrinsèque fluorescence de PA-nic. PA-Nic absorbe la lumière de ~ 405 nm et émet dans la même gamme que la protéine fluorescente verte (GFP) ou Alexa 4885. Lorsque les concentrations de PA-Nic dépassent ~ 1 mM, cette propriété de fluorescence peut rendre difficile de visualiser simultanément les structures neuronales. Pour atténuer ce, il est essentiel d’être en mesure de contrôler facilement le débit de PA-Nic de la pipette de perfusion. Périodiquement, le flux de PA-Nic a été arrêté pour permettre à des molécules fluorescentes diffuser loin. Cela a permis redéfinition du neurone pour vérifier la position au comptant de la poutre de libération. Une quatrième limitation potentielle de mentionner implique l’utilisation de 405 nm lumière de photolyse. Courtes longueurs d’onde comme 405 nm sont plus sujettes à la dispersion dans le tissu complex comme une tranche de cerveau. Ainsi, à une intensité donnée du flash et la durée, libération des amplitudes de réponse et cinétique de la décomposition peuvent être affectées différemment par la profondeur de la libération de la mise au point au sein de la tranche. Conclusions sur les aspects biologiques de Nachr devraient tenir compte de cette mise en garde importante.
Cette technique de photolyse éclair laser localisée a récemment été utilisée afin de découvrir de nouveaux détails sur la neurobiologie de la CNCDH. Par exemple, l’exposition chronique à la nicotine améliore perisomatic et fonction de la CNCDH dendritiques en médial habenula neurones5. Il était également utilisé pour aider à démontrer, pour la première fois, que les neurones glutamatergiques de l’aire tegmentale ventrale expriment Nachr fonctionnels dans leur perisomatic et les compartiments cellulaires dendritiques6. Il y a que beaucoup de potentiels futurs usages de cette technique, et l’approche pourrait être appliquée à d’autres types de neurones clés qui sont connues pour Nachr exprès, comme les neurones pyramidaux du cortex31 ou interneurones dans le cortex cérébral32, striatum33 et hippocampe19. Cette technique pourrait également être combinée avec gène pharmacologie et/ou CNCDH édition34 pour localiser les sous-types de récepteurs spécifiques aux différents compartiments neuronales. L’approche peut être facilement adaptée à d’autres composés de coumarine-cage, y compris, mais non limité à, ceux qui sont développés en parallèle avec PA-Nic5. Enfin, la photolyse éclair PA-Nic pourrait un jour être utilisé chez un animal éveillé/se comporter pour étudier l’action de la nicotine dans les paradigmes nouveaux pharmacologie comportementale.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient les membres du laboratoire des chercheurs principaux du Nord-Ouest suivants : Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy et entrepreneur de l’Anis. Ce travail a été soutenu par le nous National Institutes of Health (NIH) (subventions DA035942 et DA040626 à MDM), la Fondation PhRMA (bourse à M.C.A) et HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |