Autoradiografi som en enkel og kraftfuld metode for visualisering og karakterisering af farmakologiske mål

Summary

Metoden for Autoradiografi bruges rutinemæssigt til at studere bindingen af radioligands til væv sektioner for bestemmelse af kvalitative eller kvantitative farmakologi.

Abstract

In vitro Autoradiografi sigter mod at visualisere anatomiske fordelingen af en protein af interesse i væv fra såvel forsøgsdyr som mennesker. Metoden er baseret på specifikke bindingen af en radioligand til sine biologiske mål. Derfor, frossen væv sektioner inkuberes med radioligand løsning, og bindingen til målet er efterfølgende lokaliseret ved påvisning af radioaktivt henfald, for eksempel ved hjælp af lysfølsomme film eller fosfor imaging plader. Resulterende digital autoradiograms vise bemærkelsesværdige rumlige opløsning, der giver mulighed for kvantificering og lokalisering af radioligand binding i forskellige anatomiske strukturer. Derudover kvantificering giver mulighed for den farmakologiske karakterisering af ligand affinitet med dissociation konstanter (K_d) samt hæmning konstanter (K_jeg) og massefylden af bindingssteder (B_max) i udvalgte væv. Således giver metoden, der oplysninger om både målet lokalisering og ligand selektivitet. Her, er teknikken eksemplificeret med autoradiographic karakterisering af høj-affinitet γ-hydroxybutyric syre (GHB) bindende websteder i pattedyr hjernevæv, med særlig vægt på metodiske overvejelser vedrørende bindende assay parametre, valget af radioligand og påvisningsmetoden.

Introduction

Autoradiografi er en metode, der giver billeder af radioaktivt henfald. Teknikken bruges rutinemæssigt til at studere væv distribution af et protein af interesse i vitro baseret på en specifik farmakologisk samspillet mellem en radioaktive stof og sit mål. Dette giver direkte oplysninger om selektivitet af liganden for målet. In vitro Autoradiografi kan også anvendes til kvantitativ bestemmelse af farmakologiske bindingsparametrene af radioligands, såsom dissociationskonstant (K_d) og tæthed af bindingssteder (B_max), samt til bestemmelse af hæmning konstant (K_jeg) af konkurrerende ligander^1,2. Sammenlignet med traditionelle homogenatet radioligand bindende, har Autoradiografi fordelen at være i stand til at visualisere rumlige anatomi og med kortfattet angivelse af regionale udtryk mønstre³. Metoden til Autoradiografi er derfor et relevant alternativ til immuncytokemi, især i mangel af en valideret antistof. Autoradiografi er nemt at implementere i en standard radioisotop laboratorium givet tilgængeligheden af en passende radioligand med den påkrævede farmakologiske specificitet, adgang til en mikrotom kryostaterne til forberedelse af væv sektioner, og en egnet imaging enhed, der er i stand til at analysere fordelingen af radioaktivitet i afsnittene respektive væv. Navnlig er en vigtig udvælgelseskriterium for radioligand en begrænset mængde af binding til ikke-målarter websteder. Dette kan være at andre proteiner, membraner eller materialer som plast eller filtre, og er kollektivt benævnt ikke-specifik binding. Normalt, ikke-specifik binding er ikke-mættet men kan være mættet, hvis det drejer sig om en bestemt ud-target protein. Den bedste måde at validere sande specifikke bindende er at sammenligne med væv mangler mål, fxgenetisk manipuleret (knock-out) væv⁴.

Her, er metoden, der illustreret med en autoradiographic karakterisering af høj-affinitet bindingssted for γ-hydroxybutyric syre (GHB) i hjernen, pattedyr. Forstå den farmakologiske interaktion mellem GHB og sit bindingssted er relevant som GHB er både et klinisk nyttigt lægemiddel i behandling af narkolepsi og alkoholisme⁵, men også en naturlig bestanddel af pattedyr hjernen og et rekreativt Drug⁶. Høj-affinitet GHB bindingssteder blev først beskrevet ved hjælp af [³H] GHB binding til rotte hjernen homogenatet⁷. I år, yderligere Autoradiografi undersøgelser med [³H] GHB og analog [³H] NCS-382 har viste en høj tæthed af bindende websteder i forhjernen regioner af rotte^8,9,10, mus⁹ , gris¹¹og abe/menneske hjernen¹². Imidlertid har den molekylære identitet og nøjagtige funktionelle relevansen af disse bindingssteder forblev undvigende.

Med hensigten yderligere karakterisere bindingsstederne og lette undersøgelser på den fysiologiske rolle af GHB, flere radioligands inkorporerer forskellige isotoper begavet med forskellige tilhørsforhold har udviklet ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA og [¹²⁵jeg] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(revideret i¹⁷) (figur 1). Kombination af selektiv høj-affinitet radioligands og en meget høj væv tæthed af bindingen websteder har tilladt til fremstilling af billeder i høj kvalitet ved hjælp af fosfor imaging teknik^9,11. Sammen med en skitse af de praktiske punkter i oprettelsen af et autoradiographic eksperiment og en illustration til at eksemplificere detaljer, vil afsnittet diskussion understrege i) valget af radionuklid, ii) valget af assay betingelser og iii) anvendelse af fosfor Imaging plader versus X-ray film. Det overordnede mål med dette papir er at give videnskabelige, tekniske og metodiske detaljer på Autoradiografi teknik for at informere om væv distribution og farmakologiske analyse af protein mål.

Protocol

Alle dyr håndtering blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra den danske dyr eksperimenter inspektorat. Bemærk: Protokollen beskrevet her dækker væv forberedelse (dvs., mus hjernevæv), in vitro- autoradiographic analysen i tilstrækkelige detaljer til at konfigurere metoden i en ny lab, eksponering for fosfor imaging plader samt efterfølgende densitometric analyse af autoradiograms (figur 2) med formålet at lokalisere og kva…

Representative Results

Ved hjælp af beskrevet protokollen, anatomiske fordelingen af høj-affinitet GHB bindingssteder blev visualiseret med det radioaktive GHB analoge [3H] HOCPCA i mus hjerne, som var skåret i vandrette, koronal og sagittal sektioner (figur 3 ). Høje niveauer af bindende blev observeret i hippocampus og cortex, lavere bindende i striatum og ingen bindende blev opdaget i lillehjernen, svarende til tidligere rapporteret udtryk mønstre af høj-affinit…

Discussion

Kvaliteten af en autoradiographic analyse bestemmes oftest af følsomheden af radioligand. En stor medvirkende faktor er den valgte radioisotop, der er givet af tilgængeligheden af kendte ligander eller af gennemførligheden af specifik mærkning teknikker til at give ligander med passende specifikke aktivitet (dvs., mængden af radioaktivitet per enhed mol af en radioligand)²³og med begrænsede mængder af kemiske nedbrydning. Et stort antal radioligands af kendte ligander er mærket me…

Materials

Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597