JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

Published: March 12, 2019
doi:
10.3791/58879
, , ,
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI,Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET,Copenhagen University Hospital

Summary

Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.

Abstract

Vitro autoradiography deneysel hayvan hem de insan dokudan ilgi bir proteinin anatomik dağılımını görselleştirmenizi amaçlamaktadır. Bu yöntem bir radioligand biyolojik hedefine için belirli bağlama üzerinde dayanır. Bu nedenle, donmuş doku bölümleri radioligand çözüm ile inkübe ve bağlama hedef için daha sonra radyoaktif bozunma, algılama tarafından Örneğin, ışığa duyarlı film ya da fosfor plakaları Imaging kullanarak yerelleştirilmiştir. Elde edilen dijital autoradiograms miktar ve yerelleştirme radioligand bağlama farklı anatomik yapılar sağlar olağanüstü Uzaysal çözünürlük görüntüler. Ayrıca, miktar ligand afinite farmakolojik karakterizasyonu için ayrılma sabitleri (Kd), inhibisyon sabitleri (Kben) yanı sıra bağlayıcı siteleri (Bmax) seçili dokularda yoğunluğu aracılığıyla izin verir. Böylece, belgili tanımlık yöntem hedef Yerelleştirme ve ligand seçicilik hakkında bilgi sağlar. Burada, teknik autoradiographic karakterizasyonu siteleri bağlama tahlil ile ilgili metodolojik konuları üzerinde durularak memeli beyin dokusu içinde bağlama yüksek afinite γ-hidroksibütrik asit (GHB) örneği Parametreler, radioligand ve algılama yöntemi seçimi.

Introduction

Autoradiography radyoaktif bozunma görüntüleri sağlayan bir yöntemdir. Tekniği rutin bir protein radiolabelled bir bileşik ve hedefine arasında belirli bir farmakolojik etkileşim temel faiz vitro doku dağılımı incelemek için kullanılır. Bu hedef için ligand selectivity hakkında doğrudan bilgi sağlar. Vitro autoradiography de radioligands, bağlayıcı siteleri (Bmax), yoğunluğu ve ayrışma sabiti (Kd) gibi parametrelerin farmakolojik bağlama kantitatif tayin yanı sıra belirlemek için kullanılabilir rakip ligandlar1,2inhibisyon sabiti (Ki). Geleneksel homogenate radioligand bağlama için karşılaştırıldığında, autoradiography kayma anatomi görselleştirmek için güçlü olmak ve bölgesel ifade kalıpları3özlü ayrıntılarını veren avantajına sahiptir. Autoradiography yöntemi bu nedenle özellikle doğrulanmış bir antikor yokluğunda immunocytochemistry ilgili bir alternatiftir. Autoradiography kolayca uygun bir radioligand durumu ile gerekli farmakolojik özgüllüğü, doku bölümleri ve uygun bir görüntüleme hazırlanması için bir microtome cryostat erişim verilen bir standart Radyoizotop laboratuvar uygulanır radyoaktivite kendi doku bölümlerde dağıtım analiz yapabiliyor aygıt. Özellikle, bir önemli seçim radioligand için sınırlı bağlama hedef olmayan sitelere bir kriterdir. Bu diğer proteinler, membran veya plastik veya filtreler gibi maddeler olabilir ve toplu non-spesifik bağlama olarak anılacaktır. Genellikle, non-spesifik bağlama saturable olmayan ama belirli bir hedef kapalı protein içeriyorsa saturable olabilir. Doğru belirli bağlama doğrulama için en iyi yolu (knock-out) doku4hedef örneğin, genetik olarak eksik dokuların karşılaştırmak için tasarlanmış olduğunu.

Burada, metodoloji γ-hidroksibütrik asit (GHB) memeli beyinde yüksek afinite bağlama sitesine autoradiographic karakterizasyonu gösterilmektedir. GHB hem klinik olarak yararlı bir ilaç tedavisi Narkolepsi ve alkolizm5, aynı zamanda doğal bir kurucu memeli beyin ve bir eğlence olduğu gibi farmakolojik etkileşim GHB ve bağlama sitesi arasında alaka en önemli noktadır uyuşturucu6. Yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri ilk [3H] GHB bağlama sıçan beyin homogenate7kullanarak açıklanan. Yıllar içinde autoradiography çalışmaları [3H] ile daha fazla GHB ve analog [3H] NCS-382 siteler fare8,9,10, fare9 ön bölgelerinde bağlama yüksek yoğunluklu gösterdi ,11ve maymun/insan beyin12domuz. Ancak, bu bağlama sitelerin tam işlevsel alaka ve moleküler kimlik zor kalmıştır.

Daha fazla bağlayıcı siteleri niteleyen ve GHB fizyolojik rolü üzerinde çalışmalar kolaylaştırmak için niyeti ile birden çok radioligands farklı benzeşim ile donatılmış farklı izotoplar birleşmeyle geliştirilmiştir ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA ve [125ben] BnOPh-GHB)13,14,15,16(17‘ gözden) (şekil 1). Siteleri görüntüleme tekniği9,11fosfor kullanarak yüksek kaliteli görüntüleri üretimi için izin bağlama çok yüksek doku yoğunluğu ve seçmeli yüksek benzeşme radioligands birleşimi. Autoradiographic deney ve bir örnek ayrıntıları örneklemek için ayarlama içinde pratik noktaları bir taslağını ile birlikte, i) radyonüklid seçimi, ii) tahlil koşullar seçimi ve III) fosfor kullanımı tartışma bölümünde vurgulamak olacaktır Röntgen film karşı plakaları görüntüleme. Bu yazıda genel amacı autoradiography tekniğine doku dağıtım ve protein hedeflerin farmakolojik analizleri hakkında bilgilendirmek için teknik, metodolojik, bilimsel bilgileri sağlamaktır.

Protocol

Tüm hayvan işleme Danimarka hayvan deney Müfettişliği yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Not: Burada açıklanan protokol doku hazırlık (Yani, fare beyin dokusu), vitro autoradiographic tahlil kurma yöntemi yeni bir laboratuvarda, tabak Imaging fosfor maruz için yeterli ayrıntılı kapsar yanı sıra autoradiograms (Şekil 2) sonraki densitometric analizi Yerelleştirme ve farklı anatomik yapıları bağlamasında radioligan…

Representative Results

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri anatomik dağıtımını radiolabelled GHB analog [3H] ile görüntülenmiştir koronal, sagittal ve yatay bölüme (şekil 3 kesildi fare beynindeki HOCPCA ). Yüksek yüzey-in bağlama Hipokampus ve korteks gözlendi, alt striatum bağlamasında ve hiçbir bağlama beyincik içinde yüksek-benzeşme GHB siteleri9,<sup class=…

Discussion

Autoradiographic bir tahlil kalitesini en sık radioligand duyarlılık tarafından belirlenir. Bilinen ligandlar kullanılabilirliğini veya özel etiketleme teknikler fizibilite ligandlar uygun belirli aktivite ile (Yani, radyoaktivite miktarı verim verilir seçili Radyoizotop önemli bir faktör olduğunu bir radioligand birimi mol) başına23ve sınırlı miktarda kimyasal bozulması. Çok sayıda bilinen ligandlar radioligands hangi çeşitli yararları infers trityum<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

İş Lundbeck Vakfı (Grant R133-A12270) ve Novo Nordisk Vakfı (Grant NNF0C0028664) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Aleš Marek [3H] radioligand temini için teşekkür ederiz.

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. . Handbook of Radioactivity Analysis. , 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. . Receptor Binding Techniques. 897, (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry – Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, (2017).
  22. DeBlasi, A., O’Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. . Receptor-ligand interactions: a practical approach. , (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -. T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 – Recent progress. , (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry – issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

AutoradiographyProtein BindingPharmacological TargetsCryostat SectioningRadioligand LabelingNon-specific BindingSpatial ResolutionDigital ImagingPharmacological Analysis
check_url/58879?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image