Summary

Colletotrichum fioriniae 물, 클로 프롬 기반 블루베리와 크랜베리 꽃 추출 물 개발

Published: April 12, 2019
doi:

Summary

여기, 생물 검정 곰 팡이 병원 체의, Colletotrichum fioriniae, 유리 coverslips에 블루베리 나 크 렌 베리 꽃 추출의 개발을 모니터링 하도록 설계 된 설명 합니다. 물, 클로 프롬 및 필드 빗 물-꽃 추출 기술을 어떻게이 정보를 적용할 수 있습니다에 대 한 통찰력 뿐만 아니라 자세한 위치를 기반으로 합니다.

Abstract

피는 기간의 기후학 및 병원 체 썩 어 곰 팡이 과일에 꽃 화학 신호의 시간적 역학을 정확 하 게 모니터링 하려면 꽃 추출 방법 및 coverslip 생물 검정 개발 되었다 Colletotrichum fioriniae를 활용 하 여. 블루베리와 크랜베리,이 병원 체 감염의 초기 단계에서 역할 꽃 놀이 때문에 피는 기간 동안 살 균 제를 적용 하 여 최적으로 제어 됩니다. 여기서 설명 하는 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 꽃 추출 물 (FE) 해당 유리 coverslip 생물 검정에서 나중에 사용할 물, 클로 프롬 및 필드 빗 물 기반 메서드를 사용 하 여 얻은 했다. 다양 한 정보를 제공 하기 위해 각 철 봉사: C. fioriniae 의 동원된 꽃 화학 반응 물 (물 기반), 꽃 및 과일 표면 왁 스 (클로 프롬 기반), 및 필드 기반 모니터링의 병원 체 응답 신호 생체 외에서 관찰 한 농업 설정 이동 꽃 빗 물 수집. FE는 광범위 하 게 설명으로 어느 물 또는 클로 프롬-기반,이 두 재료 사이의 고유의 차이 대 한 보상을 설명 하는 적절 한 검정을 합니다. 꽃에서 실행 했다 빗 물 각 작물에 대 한 독특한 장치에서 수집 된 유연성과이 이렇게 다른 자르기 시스템의 응용 프로그램을 암시 했다. 생물 검정 신속, 저렴, 간단 하 고 다양 한 소스에서 물질로 꽃 화합물의 존재에 대 한 사이트별 spatiotemporal 정보를 생성 하는 기능을 제공. 이 정보 알릴 것 이다 궁극적으로 더 나은 질병 관리 전략, FE 감염 발생에 필요한 시간을 줄이기로 성장 하는 시즌 동안 병원 체 감염에 대 한 위험을 변경에 대 한 통찰력을 제공.

Introduction

Colletotrichum fioriniae Highbush 블루베리 (Vaccinium corymbosum L.), 큰 미국 적갈색 (macrocarpon V. Aiton)1,2의 과일 썩 음을 발생합니다. 이 병원 체는 C. acutatum3,4,,56 에서 최근 delineated 했다 고 블루베리 탄의 원인 요원과 회원이 크랜베리 과일 부패의 복잡, 수많은 다른 식물 질병 전세계7발생 뿐만 아니라. C. fioriniae 하지 명백한 되는 과일 성숙9의 최종 단계에서 때까지 꽃과 증상 개발 중 발생 하는 감염 한 잠재성, hemibiotrophic 라이프 스타일8, 있다. 블루베리와 크랜베리, 과일 부패 균 응용 프로그램 피는 기간 동안만 적절 하 게 제어 됩니다. 병원 체는 휴면 블루베리 꽃 봉 오리 비늘10 overwinters 하 고 꽃 중 sporulates. Conidia는 비가 시작 분산11,12 통해 캐노피를 통해 이동 하 고 inoculum 증강을 강력 하 게 꽃 기간13에 상관 되었다. 꽃은 감귤 류의 게시물 꽃 과일의 구성 요소 드롭 (PFD)14 뿐만 아니라 딸기 탄15, 두 경우 모두 일으키는 중요 한 호스트 꽃 Colletotrichum 종의 응답 Vaccinium에 고유 하지 않습니다. 병원 체를 sporulate입니다. 이러한 모든 경우 C. fioriniae 과 꽃 동안 감염 기타 병원 균에 꽃 화학 신호의 시간적 역학을 평가 하는 효과적인 방법에 대 한 필요성을 강조. 여기에 설명 된 방법으로 제공 하는 통찰력 점점 더 귀중 한 되 고 있다.

이 프로토콜 꽃 추출 (FE) 조달의 방법 하 고 유리 coverslip 생물 검정15,16을 통해 철에 대 한 C. fioriniae 응답 평가 안내. 꽃 추출 기법은 두 개의 주요 유형; 나뉩니다. 물 추출 (액티브-FE, 수동 (패스-FE), 및 필드 빗 물 기반 (rw-FE)), 그리고 클로 프롬 기반 (ch-FE)17 기사. 물 추출 물 동원 꽃 화학 단서의 검사에 대 한 수 있습니다. 이 동원된 신호 철 크게 감염16, 감염 발생에 필요한 습기를 제공 하는 속도 증가 때문에 감염의 가능성이 중요 한 구성 요소는. 또한, 그들은 꽃 자극 일로-이벤트 이전 블루베리와 다른 자르기 시스템14,16에 관찰로 중 캐노피 내내 세척 될 수 있다로 더 자연 스러운 상태를 나타냅니다. 클로 프롬 기반 꽃 기사 (ch-FE)도 호스트 표면에 병원 체 응답에 관한 귀중 한 정보17,18, conidia 취약에 입금 한 번의 초기 성장 단계를 elucidating 왁 스 제공 호스트 기관 (즉, 꽃, 난소 및 개발 과일). 병원 체 계절의 변화에 대응 호스트 표면 왁 스에도이 프로토콜을 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 따라서, 생물 검정 물 기반 FE 또는 클로 프롬 기반 FE이 두 재료 사이의 고유의 차이 완화 하기 위해 협력을 맞게 조정 됩니다.

생물 검정에서 생성 된 데이터 추출 물-기반 보조 conidiation 클로 프롬 기반 기사 보다 높은 수준의 자극 밝혀 최종 appressorial 응답 되었다, 따라서 여러 화합물 연루 철에. 흥미롭게도, 이러한 성장 반응의 둘 다 때 여러 stimulatory 화합물을 나타내는 블루베리와 크랜베리 꽃에서 실행 했다 빗 물을 사용 하 여 세척 될 수 있다 꽃의 표면에서 관찰 되었다. 따라서, 꽃 자극에 대 한 모니터링 농업 시스템에서 병원 체 성공의 확률에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.

이 프로토콜의 궁극적인 목표에 도움이 꽃이 정보를 사용할 수 있는 시작 방법론 꽃 화학 신호에 대 한 응답에서 버섯 모양 식물 병원 체에 생성 초기 생물 정보에 대 한 방법론을 제공 하는 사이트별 질병 관리 및 의사 결정 프로세스입니다.

Protocol

1. 균 분리 및 포자 현 탁 액 자연적으로 감염 된 호스트19 Colletotrichum fioriniae 를 격리 합니다. 그런 다음, 옥수수 식사 agar (CMA) 글씨의 기울기에 깨끗 한 문화를 저장. 표준 플라스틱 셀 문화 접시 (지름 9 c m)를 포함 하는 하나 명확히 V8 주스 한 천 (cV8A) (밀러에서 수정), 또는 비 명확히 V8 주스 한 (V8A)20에 (에서 CMA 경사) 문화의 플러그를 놓습니다. 식민지는 sporulate를 시작, conidia (오렌지 conidial 대 중) 다른 cV8A 또는 V8A에 행진 (표준 메 마른 루프)와 셀 문화 접시를 포함 하는 고밀도 sporulating 문화를 생산 하.참고: 균 류와 어떤 프로토콜 단계 오염 곰 팡이 문화 및 생물 검정의 가능성을 줄이기 위해 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다. 후의 성장, 표준 메 마른 루프를 사용 하 여 7 일 (만져 가볍게 conidial 질량에 루프) 고밀도 문화에서 conidia의 작은 금액을 수집 하 고 살 균 이온을 제거 된 물 (SDW) 10 mL를 포함 하는 15 mL 원심 분리기 관으로 이것을 저 어. 소용돌이이 샘플 10 s, 다음 표준 피 펫을 사용 하 여 잠수를 위아래로 여러 번 더 믹스 샘플. 그런 다음는 hemocytometer에 vortexed 샘플 한 방울 놓고 포자 농도 추정 합니다. 수 5-10 필드는 hemocytometer에 평균, 가져오고 적절 한 희석 비율 (예: 10000), 평균을 곱하면 따라서 mL SDW 당 conidial 농도 얻기. 다음 볼륨 (V)를 사용 하 여 / 농도 (C) 방정식 (V1● [1C] = V2● [C2]) 5 mL 최종 볼륨 SDW의 mL 당 105 conidia X 1.0 (SDW)와 조정. 이 포자 현 탁 액 이라고 하 고만 즉시 어느 생물 검정에 사용 하기 전에 이루어집니다. 2. 활성, 꽃 추출 물 (활성 -FE)15,16 참고: 보충 그림 1, 그림 2 보충, 보충 그림 3및 보충 영화 1참조. 신중 하 게 손을-블루베리 (4 월-5 월)와 크랜베리 (6 월-7 월) 꽃 동안 수집 분야 (보충 그림 1)에서 그들의 각각 피크 꽃. 착용 하 고 니트 릴 장갑 인간의 피부 기름 오염 억제 하 고 오염 꽃 종류 사이 크로스 샘플링 위치 (cultivars/품종/물리적 위치) 변경. 비닐 봉지 (100 x 150 mm 가방 채우기)에 블루베리 또는 적갈색 꽃 (단일 소스)를 놓고 꽃 수집 즉시 4 ° C에서 냉장 보관 합니다.참고: 액티브 추출 레안드로 외에서 수정 됩니다. (2003) 16. 이전 추출, 어떤 악화, 손상, 질병 꽃 다음 건강 한 꽃을 사용 하 여 곡선된 겸 자 (45˚ 족집게)으로 난소, sepals 및 peduncles를 제거 하 고 삭제. 만 나머지 장기 (코 롤라, 오명, 스타일과 오시)를 사용 하 여 활성- 기사에 대 한. 투박한 (150 x 150 mm)와 7 x 7 mm 퍼 널 내에서 장소, 깨끗 한 50 mL 원심 분리기 관으로 장소 잘라내어 따로 설정. 1 결합 부분 처리 9 부품 SDW 꽃 (1 wt: 9 권 비율)는 박격포에서. 부드럽게 갈아 30 유 봉과 s (샘플을 완전히 격파 하 돌). 준비 된 투박한/퍼 널을 통해 결과 펄프를 변형 하 고 원심 분리기 튜브 (50 mL)에 수집 합니다. 청소 또는 95 %EtOH 각 추출 및 따뜻한 흐르는 물 사이 새로운 박격포/유 봉을 사용 합니다. 진공 여과 장치를 준비: 부 흐 너 깔때기, 진공 필터 삼각 플라스 크 (최대 1000 mL 용량), 55 m m 원형 필터 종이, 및 진공 호스/소스 수집. 적절 한 크기의 부 흐 너 깔때기에 종이 필터를 추가 및 플라스 크, 위에 다음 물에 장치를 연결 / 소스 진공 호스를 통해 흡입 놓고 따로 설정 합니다. 더 8,055 x g에서 10 분 동안 centrifuging 여 블루베리 꽃 추출 물을 명확 하 게. 준비 된 진공 필터 장치에 상쾌한 떨어져 따르십시오, 진공 소스 설정, 상쾌한, 필터 다음 플라스 크 내용을 새로운 분리기 관 (50 mL)에 부 어. 각 여과 95 %EtOH 따뜻한 흐르는 물 사이 모든 장치 부품을 청소. 주사기를 통해 추가 필터는 0.22 µ m 기 공 크기, 살 균, 초 산 새 원심 분리기 튜브 (50 mL)에 필터와 적응. 크랜베리 꽃 추출 물, 유일한 진공 필터 종이 통해 필터링 및 플라스 크 내용을 새로운 분리기 관 (50 mL)에 부 어. 결과 준비 활성-꽃 추출 물 (액티브-FE)으로 불린다. 실험적인 사용까지 5-50 mL aliquots에-20 ° C에서 모든 물-기반 꽃 추출 물 (액티브- 패시브-, 빗 물 모음)를 저장 합니다. 여러 샘플 (샘플 유형 당 적어도 3 기사) 기사를 반복 하 여 복제를 제공 하. 3. 수동 , 꽃 추출 물 ( 통과 -FE) 16 참고: 추가 영화 2 Hand 수집 전체 블루베리 꽃 (50 g) 이상으로 하 고 수집 후 냉장 보관. 이전 추출, 꽃이 악화, 손상, 질병을 제거 하 고 그대로 꽃에서 peduncles만을 제거 합니다. 아래에 설명 된 수동- 추출 시스템은 장소에까지 준비 된 샘플을 냉동. 린스 (플라스틱 메쉬 시트, 2 개의 플라스틱 메쉬 바구니, 유리 빵 팬 및 펌프 안개 병) 오염을 방지 하기 위해 95% 에탄올 (EtOH)와 따뜻한 실행 물으로 사용 하 여 모든 구성 요소 사전. 또한 각 (2.2 단계)에서 위에서 설명한 대로 추출 및 세트 옆으로 대 한 4 레이어 투박한/깔때기/50 mL 원심 분리기 튜브를 준비 합니다. 체 준비: 플라스틱 메쉬 시트 (일명 매트 바 분명) 한 플라스틱 메쉬 바구니 (114 x 102 m m)에 배치. 두 번째, 동일, 메쉬 바구니를 거꾸로 배치 (반전) ()을 피하기 위해 SDW에 앉아 꽃 빵-팬 (127 x 229 mm) 유리 및 장소에는 메쉬 시트 위에 있는 바구니. 체에 준비 된 꽃의 50 g을 추가 합니다.참고: 또는, 작은 테스트 튜브 [정화] 바구니 사용할 수 있습니다 (, 녹색, 딸기 메쉬 파인트 바구니 들은 소스 어렵다) 원래 사용된 플라스틱 메쉬 바구니 대신. 균등 하 게 250 mL는 펌프를 사용 하 여 안개 꽃 안개 병 고 유리 빵 팬에 결선. 다음 깨끗 한 원심 분리기 관으로 여과 액 준비 투박한/퍼 널을 통해 변형. 결과 준비 라고 수동-꽃 추출 (패스-FE); (2.6 단계) 위의 당으로 저장 합니다. 95 %EtOH 각 추출 및 따뜻한 흐르는 물 사이 모든 구성 요소를 청소. 여러 샘플 (샘플 유형 당 적어도 3) 복제를 제공 하는 기사를 반복 합니다. 4. 클로 프롬-기반 꽃 추출 물 (ch-FE) 17 (2.1), 단계 위의 당으로 블루베리와 크랜베리 꽃을 수집 하 고 꽃 추출 (단계 2.2, 투박한/퍼 널 준비 없이)에 대 한 준비. 준비 된 꽃을 사용 하기 전에 때까지 냉장 하십시오. 클로 프롬으로 수행 된 모든 작업은 안전 상의 이유로 연기 후드에서 수행 되어야 합니다. 이 재료의 준비를 포함 / 유리, 추출 절차 및 검정 계수 (ch-FE를 사용 하 여 단계). 95% 모든 부품 청소 EtOH 두 번, 다음 두 번 각 추출에 대 한 오염을 방지 하기 위해 클로 프롬과: 유리 문화 관, 2 유리 비 커, 작은 스테인레스 스틸 스크린과 [유리] 대학원 실린더 스레드. 거꾸로 건조를 따로 설정 합니다. 소계 (PTFE) 줄지어 모자 95로 두 번 린스 %EtOH (클로 프롬 뚜껑의 외부 자료를 손상 할 것 이다)와 건조 따로 설정. 1 결합 부분 처리 9 부품 클로 프롬에 꽃 (1 wt: 9 권 비율) 비 커에 (꽃 다음 클로 프롬), 부드럽게 30 s, 그리고 두 번째 비 커에 스테인레스 스틸 화면을 통해 긴장에 대 한 소용돌이. 유리 문화 관 (10-15 mL)에 두 번째 비 커에서 ch-FE를 부 어 및 PTFE 캡 부착. 증발을 방지 하기 위해 parafilm으로 모자를 바꿈. 이 준비는 클로 프롬 기반 꽃 추출 물 (ch-FE) 이다. 어둠 (라이트 저하를 줄이기 위해) 4 ° C에서 실험 사용까지 샘플을 저장 합니다. 여러 샘플 (샘플 유형 당 적어도 3) 복제를 제공 하는 기사를 반복 합니다. 5. 블루베리 꽃 (BB rw-FE)16 에서 빗 물 수집 참고: 블루베리 꽃 빗 물 수집 장치 구성 연결 어댑터에 대 한 공기 스프레이 총 일회용 페인트 스프레이 컵 (컵: 여성 스레드, 어댑터: 남성 남성 스레드), 50 mL 원심 분리기 관 (폴 리 프로필 렌), parafilm, 및 플라스틱 코팅된 전선 ( 표준 전화 와이어, 개별 내부 와이어 스트랜드 내용). 빗 물 수집 장치를 만들기 전에 꽃의 실행을 잡으려고 블루베리 부시 내에서 여러 위치를 선택 합니다. 바로 아래 inflorescences (꽃) 부시 (크라운)의 아주 기본에 포함 됩니다. 줄기 (1-5 cm에서 배열 하는)이 선택 된 위치에서의 레코드 직경 장치 첨부 파일, 아래에 설명 된 사용 하는 구멍의 크기를 쓰게 됩니다. 각 선택 된 위치에 대 한 수집 장치를 만듭니다. 먼저 단계 비트 드릴 프레스에 연결 된 해당 줄기 직경 스프레이 컵 (여기서 컵 스레드 오프닝으로 곡선)의 하단에 구멍을 드릴 합니다. 그런 다음 스프레이 컵의 입에 thehole의 상단에서 직선 절단. 스프레이 컵의 입에 (충분히 큰 플라스틱 코팅 된 와이어로), 4 동일한 구멍을 드릴 하 고 한쪽 무료 떠나 플라스틱 코팅된 전선의 한쪽 끝. 충분히 큰 50 mL 원심 분리기 캡 뚜껑으로 페인트 분무기 컵 어댑터 스레드 구멍을 드릴 합니다. 어댑터 스레드 누수 방지 하기 위해 parafilm으로 밀봉. 이 원심 분리기 모자 및 분무기 컵의 뚫린된 부분을 연결 합니다. 성관계 50 mL 원심 분리기 튜브를 연결 합니다. 5.3 5.4 생성 단계를 선택한 위치, 샘플링 위치 당 4 수집 장치의 최소 당 여러 개의 장치를 반복 합니다. 줄기에 맞게 분무기 컵을 flexing 하 여 선택한 위치에 장치를 배포 합니다. 동양 (막으려고 꽃 위에 통과 하는 물 캡처) 다른 줄기에 부착 된 플라스틱 코팅 된 와이어를 사용 하 여 위쪽으로 스프레이 컵의 자르 측. 부착 parafilm 빗 물 누수 수 모든 구멍. (보충 그림 3, 보충 그림 4, 그림 5 보충, 그리고 보충 그림 6). 레이블 컬렉션 튜브 배포 날짜 / 시간. 비 이벤트 후 제거 하 고 원심 분리기 튜브의 아래쪽 (튜브) 부분을 교체 (날짜를 라벨 / 컬렉션의 시간). 내부 결선 컬렉션 (블루베리 빗 물 꽃 추출 물 (BB rw-FE) 라고 함)를 지참 하 고 진공 필터 (여과 단계 2.4-2.5에서 설명). (단계 2.6), 위에 매장 물 기반 생물 검정에 사용 될 때까지. 6. 적갈색 꽃 (CB rw-FE)에서 빗 물 수집 적갈색의 꽃 빗 물 수집 장치는 7 X 7 cm 폴 리 프로필 렌 퍼 널, 50 mL 원심 분리기 튜브 (폴 리 프로필 렌), parafilm, 이루어져 있고 4 표준, 플라스틱 코팅 트위스트 관계 (장치당). 첫째, 열 찔린 금속 프로브를 사용 하 여 깔때기의 입 주위 8 등거리 구멍 (트위스트 관계의 직경) 합니다. 트위스트 관계 4 구멍에 삽입 합니다. 깔끔한 교차 패턴을 형성, 그 구멍의 반대 위치에 다른 끝을 연결할. 퍼 널 다운 줄기 parafilm으로 포장 하 고 따로 설정 합니다. 단계 조금 50 mL 원심 분리기 모자에 퍼 널 다운 줄기를 삽입에 충분히 큰 구멍을 드릴 합니다. 원심 분리기 모자에 준비 된 퍼 널을 삽입 합니다. 6.2-6.3 생성 단계를 여러 개의 장치, 4 수집 장치 샘플링 위치 당 최소를 반복 합니다. 선택 된 크랜베리 습지에 레이블된 (날짜/시간) 장치를 배포 합니다. 깔끔하게 두 꽃 베어링 inflorescences (uprights 라고도 함) 교차 플라스틱 트위스트 관계 아래 턱. 다음 세로로 크랜베리 캐노피 (보충 그림 7-8, 추가 동영상 3)으로 원심 분리기 튜브를 관통 하 여 장치 동양. 강우량 또는 오버 헤드 관개 후 제거 하 고 원심 분리기 튜브의 아래쪽 (튜브) 부분을 교체 (날짜를 라벨 / 컬렉션의 시간). 내부 결선 (크랜베리 빗 물 꽃 추출 (CB rw-FE) 라고 함)를 지참 하 고 진공 필터 (여과 단계 2.4-2.5에서 설명). (단계 2.6), 위에 매장 물 기반 생물 검정에 사용 될 때까지. 7. 검정 물 기반으로 꽃 추출15,16 를 사용 하 여 (액티브-FE, 통과-FE, rw-FE) 참고: 그림 1을 참조 하십시오. 이 생물은 층 류 두건에 준비가 되어 있습니다. 재료 준비: 트리플 린스 유리 coverslips 95 %EtOH 공기 건조, 다음 옆으로 넣어. 표준 플라스틱 셀 문화 요리 (9 cm)의 내부 직경을 종이 타 올 디스크를 잘라. 문화 요리 내 종이 디스크의 2 레이어를 배치 하 고 2 mL SDW와 함께 담가. 1.0 X 10의 5 mL 이상5 conidia SDW 포자 현 탁 액 (C. fioriniae) 당로 (단계 1.2-1.4), 위에서 mL 당 따로 준비 합니다. 다음으로, 동등한 양의 SDW 및 2 mL에 꽃 추출 물-기반 microcentrifuge 튜브 혼합. 그런 다음, 포자 현 탁 액의 같은 볼륨 준비 2 mL microcentrifuge 튜브 (SDW 플러스 FE);을 추가합니다 결과 준비는 수성 치료 혼합물 이라고 합니다. 컨트롤에 대 한 철 부분을 생략 하 고 SDW conidial 농도 일관성 유지를 바꿉니다.참고: 부분 크기 복제 및 시간-포인트의 수에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 일부는 500 µ L을 초과 하지 마십시오. Conidia와 FE 결합 생물 검정 시작 했다, 0 h 후 접종. 젖은 종이 수건 위에 미리 청소 유리 coverslips를 셀 문화 접시에 내 놓습니다. 수성 치료 혼합물의 40 µ L 드롭릿은 coverslip의 중심에 배치 합니다. 컨트롤을 포함 하 여 원하는 치료에 대 한 반복, 셀 문화 접시를 닫습니다. 복제 (적어도 3) 이며 시간 포인트 (각 접시 1 시간 포인트)에 대 한 별도 셀 문화 요리를 반복 합니다. 일단 모든 치료 및 복제 적절 되었습니다, 모든 복제 세포 문화 요리 밀폐 플라스틱 용기 (30 x 13 x 7mm)로 놓고 어둠 속에서 25 ° C에서 품 어. 미리 정해진된 시간 지점에서 성장을 중지 하는 작은 물방울에 10 µ L lactophenol 코 튼-블루 (20.0 g 페 놀 결정, 20.0 mL 2.5% 젖 산, 글리세롤 40.0 mL, 0.05 g 면 블루) 같은 정착 액의 추가 반 보존 및 마운트. 2 h이 유리 표면에 conidial 접착을 허용 하지만 conidial 발 아에 대 한 길이가 0 h 시간 포인트를 수집 하지 싶어. 다른 모든 시간 포인트에 대 한 해당 시간에 정착 액을 추가 합니다. 정착 액을 추가 경우 coverslips, 그들에 게 아래로 물방울 측면을 배치 현미경 검사 (슬라이드 당 1 coverslip) 촉진 하기 위하여 유리 현미경 슬라이드에 반전 하는 신중 하 게. 모든 coverslips에 있는 경우 유리 현미경 슬라이드, 두고 정착 하 고 20 분 동안 흐름 후드에 부분적으로 건조. 수 중 400 X 확대 (16 필드 계산) 또는 (4 필드 계산), X 200에서 appressoria 뿐만 아니라 coverslip (기본 conidia, 세균된 conidia 및 새로 형성된 된 이차 conidia)에 존재 하는 모든 conidia (총 conidia) 총 면적 3.808 m m 2. 전체 생물 검정 통계 분석에 대 한 복제. 물 기반 FE를 사용 하 여 분석 실험, 분석 데이터 Waller 외 에 설명 된 대로 201716, 일반적으로 평균 수/m m2 (총 conidia 또는 appressoria) 표시. 8. 클로 프롬 기반 꽃 추출 (ch-FE)17 을 사용 하 여 검정 참고: 그림 2를 참조 하십시오. 재료를 준비 하 고 세포 (7.1 조치) 위에 당 문화 요리. 또한, 내 연기 후드, 유리 피 펫 (1 mL 1 µ l 단위로) 뿐만 아니라 coverslips, 밴 Tieghem 셀 (VanT.)의 동일한 수 (8 m m OD, 6 m m ID) 린스 (95%로 두 번 다음 클로 프롬으로 두 번 EtOH), 따로. 층 류 두건 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 두 개의 동일한 볼륨 SDW의 (적어도 500 µ L 부분) 및 포자 현 탁 액의 1 볼륨을 추가 다음 따로 설정. 이것은 채널-FE 생물 검정에 대 한 수성 치료 혼합물 이다. 증기 두건에서는 VanT 놓습니다. 준비 된 플라스틱 셀 문화 접시 내 유리 coverslip에 셀입니다. 특 면 (유리 피 펫) 원하는 채널-FE의 33 µ L 반 티 셀의 가운데에 (는 VanT의 벽을 다치 지 마십시오. 셀; 제어 치료에 대 한 추가 처녀 클로 프롬), 건조를허용. 복제 (적어도 3)에 대 한 별도 셀 문화 요리를 반복 합니다. 채널-FE 건조가 일단는 VanT의 센터에 표준 피 펫으로 준비 된 수성 치료 혼합물의 99 µ L을 분배. 셀, 다음 닫기 모든 세포 문화 요리. 일단 수성 치료 혼합물 건조 채널-FE 치료 접촉은, 생물 검정 시작 했다, 0 h 후 접종. 일단 모든 치료 및 복제 적절 되었습니다, 모든 (닫히는) 세포 문화 요리 밀폐 플라스틱 용기 (30 x 13 x 7mm)로 놓고 어둠 속에서 25 ° C에서 품 어. 미리 결정 된 시간-포인트에는 VanT에 정착 액 (lactophenol 면-파란색)의 15 µ L를 추가 합니다. 셀 그리고 적절 한 곰 팡이 얼룩을 보장 하기 위하여 적어도 5 분 동안 앉아서 하자. 그 시간 후, 조심 스럽게 제거는 VanT. 셀 하 고 위의 (단계 7.5-7.6) coverslip 반전 및 데이터 수집 단계에 따라. 데이터 분석, Gager 201517, 일반적으로 표시 데이터 appressorium 형성, 즉 appressoria (3.808 m m2)를 관찰 하는 영역에서 계산을 총 conidia의 비율에서에서 설명한 방법을 따릅니다. 9. 크랜베리 기후학 기반 기사17 손 수집 크랜베리 꽃 (6 월; 100 g), 미 성숙한 과일 (두 번; 7 월과 8 월; 200 g), 수확에 크랜베리 과일 성숙 (10 월; 200 g), 적절 한 크기의 비닐 봉지에 배치와 4 ° C에서 수령 후 즉시 냉장 보관. (단계 2.1) 위에서 설명한 오염 예방 조치를 사용 합니다.참고: 각 시간에서 수집 된 추가 공장 설비 재료 것 하지만이 금액 분명 곰 팡이 감염 된 난소와 과일 (증상 및 질병의 표시를 보여주는) 추출 방지. 이전 추출, 어떤 악화, 손상, 질병 꽃 다음 곡선된 겸 자 (45 ° 족집게)으로 sepals, peduncles, corollas, 낙인, 작풍 및 stamens를 제거 하 고 난소를 제외한 모든 삭제만 건강 한 꽃을 사용 하 여. 일단 난소 수집 수행 1에서 클로 프롬 기반 추출 wt: 9 집 비율 (난소만을 사용 하 여 4.2-4.4, 단계에 자세히 설명). 다른 모든 기사, 완료 될 때까지 샘플을 저장 , 즉 검정 전도성까지. 일단 과일 수집, 클로 프롬 기반 추출 (4.2-4.4 사용 하 여 단계 수집된 과일 꽃 대신), 하지만 클로 프롬의 90 mL에 과일의 10 g를 추가 하 고 한 번 추출, 솔루션 (10 g: 9 mL wt 결과 9 mL를 증발을 허용합니다 : 집 솔루션). 7 월, 8 월, 그리고 10 월에 수집의 직후 과일 기사를 확인 합니다. 모든 기사는 수집 될 때까지 (4.4 단계) 위의 당으로 저장 합니다. 마지막 클로 프롬 기반 과일 추출 후 모든 클로 프롬 penology 기반 추출 물을 클로 프롬 기반 생물 검정에이 분석 결과 대 한 수집 대상이 고 따라서 분석 (8.1 8.6 단계).

Representative Results

여기에 제시 된 결과이 방법론을 사용 하 여 수행할 수 있는 많은 분석 실험의 몇 가지 예입니다. 그림 1 은 물 기반 FE 검정에 그림된 가이드 그리고 그림 2 는 클로 프롬 기반 FE 생물 검정에 의해 보충. 그림 3 에서는 무슨 C. fioriniae 의 미세한 평가 두 물 및 클로 프롬 기반 생물 검정 (비교 SDW 컨트롤)에서 24 시간에 따라 예상 될 수 있는 시각적 가이드. 그림 4 크랜베리 다양 한 ‘스티븐 스’ 채널-FE, 존재 C. fioriniae 는 24 시간 코스 연구 하 고이 연구의 결과 가져오기에 대 한 시각적 참조를 제공: FE 감염 구조를 형성 하는 데 필요한 시간을 감소 SDW에 비해. 그림 5 는 coverslip 검정 적갈색 꽃 빗 물 흐르는 빗 물 (CB “꽃” rw-FE)를 사용 하 여에서 수집 된 데이터의 예를 제공 합니다. 그림 6 다른 중요 한 결과 나타냅니다: 꽃 난소 채널-FE은 훨씬 더 보다 과일 채널-FE, 꽃의 수명 주기에서의 중요성을 나타내는 물질로 C. fioriniae. 추가 사진 및 동영상 추출 및 꽃 빗 물 수집 장치/배포, 시각화 및 액티브- 패시브- 추출 (영화 이외에 사용 하는 꽃의 중요 한 영상을 제공합니다 물 기반) 프로세스입니다. 그림 1 : 꽃 물-기반의 일반 개요 추출 (FE) 검정. 이 분석 결과 블루베리와 크랜베리 꽃 꽃 추출 물-기반에 대 한 이용 되었다: 액티브-꽃 추출 (액티브-FE), 수동-꽃 추출 (통과-FE)와 꽃 빗 물 흐르는 빗 물 (rw-FE). -FE 일반적으로 실험/변수 요소를 구성 하는 부분. 반대로-FE 부분 일정 하 게 유지 수 및 시간 포인트/시간 후 접종을 평가할 수 있다. 200 X 배율에서 4 필드 분석으로 설정이 했다. 약어: 살 균 이온된 수, SDW; A. 보기의 필드 당 지역 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 꽃의 클로 프롬 기반 일반 개요 추출 (ch-FE) 검정. 이 분석 결과 블루베리와 크랜베리 (꽃, 난소 및 과일)를 위해 이용 되었다. 이 분석 결과, 1 부분 포자 정지 (conidial 농도 채널-FE 증발 때문에 일관성 유지)에 2 개 부품 SDW 수성 치료 혼합물의 한 유형을 사용 되었다. 이 분석 결과 여러 채널-FE (다양 한 식물 표면에서 왁 스), 또는 여러 시간 포인트/시간 후 접종 단일 채널-FE를 사용 하 여 비교에 사용할 수 있습니다. 약어: 살 균 이온된 수, SDW; 반 Tieghem [유리] 셀, VanT입니다. 셀입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : Colletotrichum fioriniae 물 기반 FE와 채널-FE 존재의 시각적인 비교. 이 분석 결과 블루베리 ‘Bluecrop’에서 (활성-FE, 물 기반) (곰 팡이 분리: BB #10)와 크랜베리 ‘스티븐 스’ 클로 프롬 기반 (ch-FE) (곰 팡이 분리: CB PMAP182) 꽃 추출 SDW 컨트롤에 비교 했다. Conidia SDW (제어) (A) 활성의 존재를 비교할 때 보조 conidiation (반지)과 appressorium 형성 (화살촉)에 극적인 증가 관찰 했다-24 h 후 접종에 FE (B) . 그러나, 보조 conidiation이 아니었다으로 명백한 채널-FE (D);을 클로 프롬 검정 SDW 제어 (C)을 비교 했을 때 오히려, C. fioriniae 성장 appressorial 형성 쪽으로 이동. 표시 된 각 추출 유형, 물 기반에 대 한 일반적인 응답 이며 클로 프롬-기반으로, 호스트/꽃 종에 설명. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : 시간-과정 연구 (24 시간) Colletotrichum fioriniae 채널-FE 존재. 이 분석 결과에서 SDW 제어 (A-D) 와 크랜베리 ‘스티븐 스’ 채널-FE (E-F) 시각적으로 검사 했다 0, 6, 12, 그리고 24 시간 후 접종 (여러 FE를 비교 하는 대신 가변 시간 점의 예). Appressorium 형성 (화살촉) 채널-FE에 6 h에서 시작 되 고 이후의 시간 포인트에 걸쳐 꾸준히 증가. 이 결과 피는 기간 동안 병원 체 생물학의 중요 한 요소를 회피 한다: 꽃 감염 구조를 형성 하는 데 필요한 시간을 단축. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 한 생물 검정에 rw-FE를 사용 하 여 수집 된 데이터를 그래픽으로 표시. 빗 물 크랜베리 꽃 (CB “꽃” rw-FE)의 실행 및 단일 일로 이벤트 플러스는 표준 활성, 적갈색 물 꽃 추출 물 (CB 활성에서 어떤 크랜베리 식물 조직 (“땅” rw-FE) 손도 안 했다 처녀 빗 물 -FE) (긍정적인 제어)와 SDW (부정적인 컨트롤) 물 기반 coverslip 검정을 받게 되었고 C. fioriniae 성장에 대 한 평가. CB “꽃” rw-FE는 표준 CB로 활성보조 conidiation 및 appressorium 형성의 동일한 수준을 했다-수집 장치 캡처 동안 발표 하는 꽃 자극에 효과적 이었다는 것을 나타내는 24 h 후 접종에서 FE는 일로-이벤트입니다. 총 conidia (입금) 기본, conidia 및 새로 형성된 된 이차 conidia 구성 됩니다. 문자 나타냅니다 p < 0.05 피셔의 적어도 상당한 차이 따라 상당한 차이가 테스트 (LSD); 대문자, 총 conidia; 소문자, appressoria입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6 : 크랜베리 기후학 기반 채널-FE 검정, 육안 검사. 종종 곰 팡이 썩는 과일에 대 한 질병 관리 꽃 시간 균 응용 프로그램을 포함 한다. 여기, 크랜베리 클로 프롬 기반 추출 물 (ch-FE) 적갈색 (‘스티븐 스’)의 여러 성장 단계에서 24 시간 후 접종에서 C. fioriniae 에 표면 왁 스의 효과 대 한 시각적으로 평가 했다. 6 (A), 7 월과 8 월에 수집 하는 미 성숙한 과일에에서 난소 수집 (B, C), 수확된 과일 10 (D), 월에서 수집과 SDW 컨트롤 (E) appressorial 형성 (화살촉)에 대 한 검사를 했다. 난소 채널-FE appressorial 형성,이 식물 기후학 (꽃) C. fioriniae의라이프 사이클에 매우 중요 하다의 가장 큰 크기를 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 1: 블루베리 꽃이 핌. 블루베리 꽃 만개 (뉴저지, 미국에서에서 4-5 월) 동안 기사 (‘Bluecrop’ 참조)에 대 한 수집 했다. 인접 한 꽃에서 corollas/난소의 중복 및 보충 그림 2 (적갈색 수직)에 비해 꽃이 핌의 전반적인 아키텍처를 note. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 2: 크랜베리 직. 크랜베리 꽃 만개 (뉴저지, 미국에서에서 6 월-7 월) 동안 기사 (‘스티븐 스’ 표시)에 대 한 수집 했다. Note 크랜베리 단일 화 서 (직 립), 그리고는 갈고리에 다양 한 꽃 단계, 코 롤 라의 형태를 유지 하는 물방울. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 3: 블루베리 빗 물 배포 (꽃). 블루베리 꽃 빗 물 수집 장치, 클러스터 inflorescences의 바로 아래 배치 완료. 플라스틱 코팅 와이어를 수직으로 하는 장치 사용 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 4: 블루베리 빗 물 배포 (줄기). 완성 된 블루베리 꽃 빗 물 수집 장치, 줄기는 꽃이 핌과 부시 대통령의 아래 절반 방법 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 5: 블루베리 빗 물 배포 (크라운). 블루베리 꽃 빗 물 수집 장치, (크라운) 부시 대통령의 기지에 배치 완료. 참고 플라스틱 코팅된 전선 필요 하지 않은 경우 제거할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 6: 블루베리 빗 물 배포 (접지). 처녀 빗 물 수집 장치, 블루베리 나무에 인접 한 배치 완료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 7: 크랜베리 빗 물 배포 (클로즈업). 깔끔하게 교차 와이어 타이 아래 자리 잡고 두 uprights 크랜베리 꽃 빗 물 수집 장치, 완료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 8: 크랜베리 빗 물 배포. 다중 크랜베리 꽃 빗 물 장치 늪지에 배포 완료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 영화 1: 활성, 물 기반 꽃 추출 물 (액티브-FE). 추가 비디오 지원 단계 2.3-2.5.1. 블루베리 ‘Bluecrop’ 꽃 사용 되었다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.) 보충 영화 2: 수동, 꽃 추출 물 (통과-FE). 추가 비디오 지원 다음 단계 3.3-3.4. 블루베리 ‘Bluecrop’ 꽃 사용 되었다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.) 보충 영화 3: 크랜베리 꽃 빗 물 수집 장치 배포. 추가 비디오 지원 다음 6.4 단계. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

Discussion

C. fioriniae 응답 꽃 추출 물 (FEs)을 감지 하는 생물 검정 블루베리와 크랜베리 열매에 대 한 부패 pathosystems 개발 했지만 다른 원 예 작물에 쉽게 적용할 수 있습니다. 위의 상세한 프로토콜 포함 하 여, 많은 중요 한 데이터 집합을 얻는 귀중 한 되었지만에 국한 되지 않음: 시간 코스 정보 다양 한 FEs의 존재 곰 팡이 성장 단계에 관련 된 수많은 병원 체의 여러 격리에 FE 효과 추출 기법 비교, C. fioriniae 성장과 분화, 개별 꽃 기관의 평가에 개별 화학 물질의 추출, C. fioriniae FE, 효과 존재 동안에 온도 효과 기후학 종속 왁 스 기사와 꽃 빗 물 효과. 이러한 기술을 사용 하 여 생성 된 데이터 제공 C. fioriniae 생활의 많은 명확 하 게 이해 단계 및 꽃 기간은 병원 체 썩 어 많은 열매의 관리에 중요 한 이유를 부분적으로 보통 또한 있다.

처음에, 모든 꽃은 활성동일 하 게 처리 된-FE, 하지만 추출 과정 전체 꽃을 사용 하 여 쪽으로 이동 했습니다. 꽃 해 부 시간이 소요 되었고 결과 FEs의 bioactivity에 매우 작은 영향을 했다. 그러나, 개별 꽃 기관 수 있고 되어 평가 사용 하 여이 프로토콜, 하지만 신중 해야 합니다로 이동 완전히 꽃 조직 (보충 영화 1, 2.3 단계에 대 한 자세한 주의 사항), macerate이 될 수 있습니다 릴리스 미세한 평가 왜곡 수 있는 철에 곰 팡이-독성/정적 화합물. 등 패스-침략 적 기사 덜 FE (보충 영화 2) 및 rw-FE는 수집의 그들의 용이성으로 인해 더 유리한 지금. 또한, 이러한 추출 기법 생물학적으로 활성 꽃 화학 신호를 얻으려고만 진공 여과 필요 합니다.

모든 기사에 이용 하는 꽃은 일반적으로 0-3 냉장 일전 추출 준비. 이 프로토콜의 도전 FE 회전율 (추출의 저장 장치를 통해 필드 컬렉션)의 시간 관리 이다. 이 여러 소스와 날짜에서 수많은 샘플에 의해 악화 되었다. 냉동된 꽃 해 동된 꽃 표시 악화 및 변색, 실제 정도로 평가 하지 않았습니다. 그러나, 일단 물 기반 FEs 준비 된, 냉동을 반복 하 고 녹고에 아무런 영향을 보이고 있다 그래서 만큼 철 FE의 bioactivity는 신속 하 게 검정 준비 (가능한 3 년 된 FE) 후 refrozen.

클로 프롬 기반 추출 유리 coverslips에 채널-FE 증발을 통해 2 차원 평면에서 3 차원 꽃/과일 표면 왁 스 병원 체 응답의 조사 수 있습니다. 그러나, 채널-FE에서 입금 하는 왁 스의 실제 결정 구조는 그들이 수집 표면에 동일 가능성이 크다. 만약 곰 팡이 응답 특정 왁 스 구조에서 vivo에서 조사의 주요 초점 의미, 보완 기술 구현 되어야 합니다. 클로 프롬 기반 추출 물에 기초를 둔 기사 보다 더 많은 스토리지 유지 보수가 필요합니다. 어둠 속에서 ch-FE 추출 물 유지, 이외 줄지어 PTFE 세포 배양 모자와 증발 누수에 대 한 정기적으로 검사할 필요가 포장 씰링 parafilm 튜브를 필요에 따라 대체.

꽃 빗 물 유출 모니터링의 개념 특정 질병 모니터링 도구 발전의 아이디어에 뿌리입니다. 빗 물 수집 장치 컬렉션 장치 캡처 빗 물 꽃의 실행으로 다른 많은 식물 구조에 적응 될 수 있다. 이 이렇게 꽃 자극의 어떤 주어진된 시간에 필드에 존재 하는 및 시즌 내내 감시 될 수 있다 여부에 정보를 제공 합니다. 또는, 수집 장치는 얼마나 꽃 단서는 세탁 주어진 동안 일로 이벤트를 확인 하려면 여러 캐노피 위치에 배포할 수 있습니다. 미래에 실험, rw-FE 쓰게 됩니다 균 응용 프로그램을 시작 해야 하 고 때 그들은 안전 하 게 끝낼 수 있습니다. 또한, 기후학 종속 왁 스 기사 (프로토콜 섹션 9)를 모니터링 하 여 병원 체 생물학 꽃 기간의 중요성이 되고있다 훨씬 더 분명. 그 부분 또한 일시적으로 분리 되어 있는 호스트 표면 왁 스의 측면-의해-측면 비교를 위해 사용할 수 있는 메서드를 제공 하, 이러한 생물 검정의 유연성을 보여 주기 위해 포함 되었다. 꽃 추출 기술과 생물 검정을 사용 하 여 생성 하는 데이터 유형 지표를의 병원 체, 병원 체 생물학, 및 미래 제어 전략을 위한 목표에 중요 한 특정 화학 클래스를 나타냅니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 윌리엄 S. 하인즈, 미스터 부여 크랜베리 연구 기금 뉴저지 블루베리와 크랜베리 연구 협의회, Inc. 지원에 대 한 감사. 우리는 또한 제니퍼 Vaiciunas (지도 꽃 준비), 크리스틴 Constantelos (곰 팡이 문화 및 꽃 준비), 데이비드 존스 (꽃 준비 및 기사), 랭 글 리 Oudemans (꽃 준비, 촬영/사진), 제시 감사 합니다. 린치 (꽃 준비), 록 산 Tumnalis (일반 지원), 그리고 수많은 학생/여름 수련.

Materials

0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter VWR 101102-280 Blueberry floral extract (FE) clarification 
200-1000 µl pipette with tips Equipment, any make within range will be adequate
40-200 µl pipette with tips Equipment, any make within range will be adequate
5-40 µl pipette with tips Equipment, any make within range will be adequate
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter  Harbor Freight 97098 Blueberry rainwater (rw-)FE collection
Autoclave Amsco 3011 Equipment, media preparation
Bar mesh matting (plastic mesh sheet) Winco BL-240 Passive (pass)-FE collection
Benchtop timer Fisher Scientific 06-662-47 Equipment, FE preparation
Black pressure/vacuum hose VWR 62994-795 Vacuum filter component
Buchner funnel Coors USA 60240 Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks
Bunsen burner   Equipment
Calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Media component
Centrifuge Sorvall  RC 5B Plus Equipment
Centrifuge tubes (15 ml) Fisher Scientific 05-527-90 Equipment
Centrifuge tubes (50 ml) VWR 10025-694 Equipment, rw-FE collection
Cheesecloth (grade 50) Fisher Scientific AS240 Equipment, FE preparation
Chloroform VWR JT9175-3 Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free
Corn Meal Agar (CMA) Fisher Scientific B11132  Pre-mix media, isolate storage on slants
Cotton-blue stain Sigma-Aldrich 61335 Lactophenol cotton-blue stain
Curved forceps (45˚) Fisher Scientific 10-270 Equipment, flower processing and coverslip inversion
Difco Agar VWR 90004-032 Media component
Drill-press Delta Equipment, rw-FE collection
EASYpure LF Ultrapure water Barnstead D738 Equipment, deionized water source
Ethanol (95%) Chemical
Filter flask (500 ml) Pyrex No. 5340 Vacuum filter component
Freezer (set to -20˚ C) Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE 
Fume hood Hamilton Equipment, chloroform usage
Funnel (7 X 7 cm)  VWR 60820-110 Cranberry rw-FE collection, FE preparation
Generic glass slide  Fisher Scientific 22-038-101 Bioassay conductance
Generic plastic pump spray bottle VWR 16126-454 pass-FE collection, at least 250 ml capacity
Glass cell culture tubes Storage of ch-FE
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B Bioassay conductance
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)
Glass-pipette (1-100 µl) Hamilton Co. Inc. #710 ch-FE bioassay
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Lactophenol cotton-blue stain
Hemocytometer Bright-Line 5971R10 Equipment
Incubator (set to 25˚ C, dark) Percival  50036 Equipment, bioassay conductance
Lactic acid Sigma-Aldrich W261106 Lactophenol cotton-blue stain
Laminar flow hood Labconco 3730400 Equipment, sterile work environment
Metal probe (generic)  Equipment 
Microcentrifuge tubes (2 ml) Fisher Scientific 05-408-138 Aqueous treatment mixture storage and preparation
Microscope, Leica DMLB Leica 020-519.010 Equipment
Mortar (ceramic) Coors USA 60313 Vacuum filter component
Nitrile gloves  Fisher Scientific 19-130-1597D Flower collection
Paper disks (cut paper towels) Office Basics KCC01510 humidity control in bioassay
Parafilm Bemis PM-996 Plastic paraffin film 
Pestle (ceramic) Coors USA 60314 Vacuum filter component
Phenol crystals Fisher Scientific A92-100 Lactophenol cotton-blue stain
Plastic bags (~100 mm X 152 mm) Uline S1294 Equipment, flower refrigeration
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)  Fisher Scientific FB0875712 (Petri dish), bioassay conductance
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps  VWR 60927-228 Storage of ch-FE
Pyrex beakers (100 ml) Pyrex No. 1000 Preparation of ch-FE
Pyrex bread-pan pass-FE collection
Pyrex graduated cylinder Equipment, FE preparation
Refrigerator (set to 4˚ C) Equipment, storage of ch-FE
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)  Bioassay conductance
Sharp-pointed dissecting scissors Fisher Scientific 8940 Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks
Stainless steel mesh strainer VWR 470149-756 Preparation of ch-FE
Step drill bit (step-bit) Dewalt Equipment, rw-FE collection
Sterile loop (combi-loop) Fisher Scientific 22-363-602  Culture preparation
Telephone wire (internal wires) Blueberry rw-FE collection
Test tube basket  VWR 470137-792 Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket 
V8 Juice Campbell's Soup Company Fungal media component
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets Donation pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)
Vortex Genie (Vortex) Fisher Scientific 12-812 Spore suspension preparation
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles Whatman 1001-055 Vacuum filter component
White plastic twist ties (100 mm) Uline S-566W Cranberry rw-FE collection

References

  1. Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167 (2016).
  2. Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
  3. Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
  4. Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
  5. Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
  6. Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
  7. Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
  8. Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
  9. Milholland, R. D. . Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , (1995).
  10. DeMarsay, A. . Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , (2005).
  11. Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
  12. Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
  13. Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86 (2002).
  14. MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
  15. Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
  16. Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
  17. Gager, J. . The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , (2015).
  18. Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
  19. Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
  20. Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).

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Waller, T. J., Gager, J. D., Oudemans, P. V. Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts. J. Vis. Exp. (146), e58880, doi:10.3791/58880 (2019).

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