JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Chemistry

Escherichia coli-baseret celle-fri proteinsyntesen: protokoller for en robust, fleksibel og tilgængelig platformteknologi

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

Denne protokol beskriver de skridt, omkostninger og nødvendige udstyr til at skabe E. coli-baseret celle ekstrakter og gennemføre in vitro- protein syntese reaktioner inden for 4 dage eller derunder. For at udnytte de fleksible karakter af denne platform for brede programmer, diskuterer vi reaktionsbetingelser, der kan tilpasses og optimeret.

Abstract

I de sidste 50 år fremstod celle-fri Protein syntese (CFPS) som en kraftfuld teknologi til at udnytte transcriptional og translationel kapaciteten af celler i et reagensglas. Længere behov at bevare levedygtigheden af cellen, og ved at fjerne den cellulære barriere, har CFPS været grundlagsforskning til nye applikationer i biomanufacturing af traditionelt udfordrende proteiner, samt programmer i rapid prototyping for metaboliske engineering, og funktionel genomforskning. Vores metoder til gennemførelse af en E. coli-baseret CFPS platform give nye brugere adgang til mange af disse programmer. Her, beskriver vi metoder til at forberede ekstrakt ved hjælp af beriget medier, forbløffet kolber og en reproducerbar metode til afstemmelige sonikering-baserede celle lysering. Denne ekstrakt kan derefter bruges til protein udtryk kan producere 900 µg/mL eller mere af super mappe grøn fluorescerende proteiner (sfGFP) i bare 5 h fra eksperimentel opsætning til dataanalyse, at passende reagens bestande har været forberedt på forhånd. Anslået start omkostninger at opnå reagenser er $4.500, som vil opretholde tusindvis af reaktioner på en anslået udgift af $0.021 pr. µg af protein produceret eller $0.019 pr. µL af reaktion. Derudover spejl protein udtryk metoder lethed af opsætningen reaktion ses i kommercielt tilgængelige systemer på grund af optimering af reagens forblandinger, på en brøkdel af prisen. For at muliggøre bruger hen til leverage den fleksible karakter af fælles fiskeripolitiks platform for brede programmer, har vi identificeret en række aspekter af den platform, der kan være tunet og optimerede afhængigt af de disponible ressourcer og protein udtryk resultater ønskede.

Introduction

Celle-fri Protein syntese (CFPS) fremstod som en teknologi, der er låst op en række nye muligheder for protein produktion, funktionel genomforskning, metabolisk engineering og mere inden for de sidste 50 år1,2. I forhold til standard i vivo protein udtryk platforme, CFPS giver tre vigtige fordele: 1) den celle-fri karakter af platformen muliggør fremstilling af proteiner, der ville være potentielt giftige eller udenlandske med celle3,4 ,5,6; 2) inaktivering af genomisk DNA og indførelsen af en skabelon DNA kodning molekylærgenetisk interesse kanal al den systemiske energi inden for produktionen af de(n) reaktion af interesse; og 3) den åbne karakter af platformen gør det muligt for brugeren at ændre og overvåge de reaktionsbetingelser og sammensætning i realtid7,8. Denne direkte adgang til reaktionen understøtter forstærkning af biologiske systemer med udvidet kemi og redox forhold for produktion af nye proteiner og tuning af metaboliske processer2,9, 10. direkte adgang også tillader bruger hen til kombinere fælles fiskeripolitiks reaktion med aktivitet assays i en single-puljen system for hurtig design-build-testen arbejdscykler,11. Kapacitet til at udføre fælles fiskeripolitiks reaktion i lille volumen dråber eller på papir-baserede enheder yderligere understøtter høj overførselshastighed discovery indsats og rapid prototyping12,13,14,15 ,16. Disse fordele og plug and play arten af systemet, CFPS entydigt har aktiveret en række bioteknologiske applikationer såsom fremstilling af proteiner, der er vanskeligt at solubly udtrykkelig i vivo17, 18,19,20, påvisning af sygdommen21,22,23, på efterspørgslen biomanufacturing18,24 ,25,26,27, og uddannelse28,29, som alle udvise fleksibilitet og nytte af den celle-fri platform.

CFPS systemer kan genereres fra en bred vifte af rå lysates fra begge prokaryote og eukaryote cellelinier. Dette giver mulighed for forskellige muligheder i systemet af valg, hver især har fordele og ulemper afhængigt af anvendelsen af interesse. CFPS systemer også varierer meget i forberedelsestid, omkostninger og produktivitet. Mest udnyttet almindeligt celle ekstrakter er produceret fra hvedekim, kanin reticulocyte, insekt celler og Escherichia coli celler, hvor sidstnævnte er den mest omkostningseffektive til dato, mens der producerer de højeste volumetriske udbytter af protein30 . Mens andre CFPS systemer kan være en fordel for deres medfødte posttranslationel modifikation maskiner, nye applikationer ved hjælp af E. coli-baserede maskiner er i stand til at bygge bro over kløften ved at generere site-specifically fosforyleres og glykosyleret proteiner på efterspørgslen31,32,33,34,35.

CFPS reaktioner kan køres i enten batch, kontinuerlig udveksling celle-fri (CECF) eller kontinuerlig flow celle-fri (CFCF) formater. Batch-formatet er et lukket system, hvis reaktion levetid er begrænset på grund af faldende mængder af reaktanter og ophobning af hæmmende biprodukter af reaktionen. CECF og CFCF metoder øge levetiden for reaktionen, og resultere dermed i øget volumetriske protein udbytter i forhold til batch reaktion. Dette opnås ved at tillade biprodukter af proteinsyntese skal fjernes fra reaktion fartøj, mens nye reaktanter leveres i løbet af reaktion2. For CFCF, kan protein af interesse også blive fjernet fra reaktionskammeret, mens i CECF, protein af interesse er fortsat i reaktionskammeret består af en semipermeabel membran36,37. Disse metoder er særligt værdifuldt i at overvinde fattige volumetriske udbytter af vanskelige at express proteiner af interesse38,39,40,41,42, 43. Udfordringer i forbindelse med gennemførelsen af CECF og CFCF tilgange er, at 1) mens de resulterer i mere effektiv brug af bio maskiner ansvarlig for transskription og translation, de kræver især større mængder reagenser, der øger samlede omkostninger og 2) de kræver mere kompleks reaktion opsætninger og specialiseret udstyr i forhold til batch format44. For at sikre tilgængelighed for nye brugere, beskrevet protokollerne heri fokus på batch format på reaktion mængder af 15 µL med specifikke henstillinger for at øge reaktion volumen til milliliter skala.

De metoder, der præsenteres heri aktiverer ikke-eksperter med grundlæggende laboratorium færdigheder (f.eks. studerende) at gennemføre cellevækst, udtrække forberedelse og batch format reaktion setup for en E. coli-baseret CFPS system. Denne tilgang er omkostningseffektive sammenlignet med kommercielt tilgængelige kits uden at ofre lethed af kit-baserede reaktion setup. Desuden, denne tilgang giver programmer i laboratoriet og i marken. Når det besluttes at implementere CFPS, bør nye brugere grundigt evaluere effektiviteten af konventionelle protein udtryk systemer opstart investeringer, som CFPS ikke kan være overlegne i hvert enkelt tilfælde. CFPS metoder beskrevet her muliggøre bruger hen til direkte gennemføre en lang række applikationer, herunder funktionel genomforskning, høj overførselshastighed afprøvning, produktion af proteiner, der er vanskelige for i vivo udtryk, som feltet applikationer, herunder biosensorer og undervisnings kits for syntetisk biologi. Yderligere programmer såsom metabolisk engineering, tuning af protein udtryk betingelser, sygdom og registrering skala-up ved hjælp af CECF eller CFCF metoder er stadig muligt, men kan kræve erfaringer med fælles fiskeripolitiks platform for yderligere ændring af reaktion betingelser. Vores metoder kombinere vækst i beriget medier og forbløffet kolber, med relativt hurtige og reproducerbare metoder til celle lysis gennem sonikering, efterfulgt af en forenklet CFPS reaktion setup, der udnytter optimeret forblandinger45. Mens de cellulære vækst metoder er blevet noget standardiseret inden for dette felt, varierer metoder til celle lysis meget. Ud over sonikering omfatter fælles lysis metoder udnyttelse af en fransk presse, en homogeniseringsapparat, perle piskeris, eller lysozym og andre biokemiske og fysiske forstyrrelser metoder46,47,48, 49. ved hjælp af vores metoder, ca. 2 mL rå celle ekstrakt er opnået per 1 L af celler. Denne mængde af celle ekstrakt kan støtte fire hundrede 15 µL CFPS reaktioner, hver producerende ~ 900 µg/mL reporter sfGFP protein fra skabelon plasmidet pJL1-sfGFP. Denne metode koster $0.021/µg af sfGFP produceret ($.019/µL af reaktion), bortset fra omkostningerne til arbejdskraft og udstyr (supplerende figur 1). Start fra bunden, denne metode kan gennemføres i 4 dage af en enkelt person og Gentag CFPS reaktioner kan være afsluttet inden for timer (figur 1). Derudover kan protokollen skaleres i volumen for større partier af reagens til brugerens behov. Vigtigere, kan protokollen præsenteres her implementeres af ikke laboratorium uddannet-eksperter som studerende, da det kun kræver grundlæggende laboratorium færdigheder. De procedurer, der er beskrevet nedenfor, og den tilhørende video er blevet specifikt udviklet for at forbedre tilgængeligheden af E. coli CFPS platform for bred anvendelse.

Protocol

1. medier forberedelse og cellevækst Dag 1 Streak E. coli BL21*(DE3) celler fra en glycerol lager på en LB-agar plade og Inkuber i mindst 18 timer ved 37 ° C. Forberede 50 mL LB medier og autoklave løsningen på en flydende cyklus for 30 min ved 121 ° C. Opbevares ved stuetemperatur. Dag 2 Forberede 750 mL 2 x YTP medier og 250 mL 0,4 M D-Glucose opløsning, som beskrevet i de supplerende oplysninger. …

Representative Results

Vi har præsenteret en sonikering-baserede E. coli ekstrakt forberedelse protokol, der kan gennemføres over en fire-dages span, med figur 1 viser den proceduremæssige fordeling over hver dag. Der er formbarhed til de skridt, der kan udfyldes hver dag med forskellige midlertidigt stop punkter, men vi har fundet denne arbejdsproces til at være den mest effektive til at udføre. Derudover både celle pellets (trin 1.3.18) og fuldt forberedt ekstrakt …

Discussion

Celle-fri proteinsyntesen fremstod som en kraftfuld og aktivering teknologi for en lang række applikationer lige fra biomanufacturing til rapid prototyping af biokemiske systemer. Bredden af programmer understøttes af kapacitet til at overvåge, manipulere, og øge cellulære maskiner i realtid. På trods af den ekspanderende effekt af denne platformteknologi, brede tilpasning er forblevet langsomt tekniske nuancer i gennemførelsen af metoderne. Gennem denne indsats tilstræber vi at give enkelhed og klarhed for at et…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, og Tony Turretto for teknisk support, Wesley Kao, Layne Williams og Christopher Hight til nyttige diskussioner. Forfatterne også anerkende finansieringen støtte fra Bill og Linda Frost fond, Center for programmer i bioteknologis Chevron bioteknologi anvendt forskning Endowment Grant, Cal Poly forskning, akademisk og kreative aktiviteter Grant Program (RSCA 2017), og National Science Foundation (NSF-1708919). MZL anerkender California State University Graduate Grant. MCJ anerkender hær forskning Office W911NF-16-1-0372, giver National Science Foundation MCB-1413563 og MCB-1716766, Air Force forskning laboratorium Center af Excellence Grant FA8650-15-2-5518, Defense trussel reduktion agenturet Grant HDTRA1-15-10052/P00001, David og Lucile Packard Foundation, Camille Dreyfus lærer-Scholar Program, Institut for energi BER Grant DE-SC0018249, menneskelige grænser Science Program (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP Grant, og Chicago biomedicinsk konsortium med støtte fra Searle midler på Chicago Fællesskabet Trust for støtte.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer’s disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Tags

Escherichia ColiCell-free Protein SynthesisProtocolPlatform TechnologyFunctional GenomicsBiosensorsMetabolic EngineeringGenetic Code ExpansionCentrifugationS30 BufferDTTResuspensionAliquoting
check_url/58882?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image