JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Abstract

Son 50 yılda, boş hücre Protein sentezi (CFPS) tüp bebek hücrelerde transkripsiyon ve çevirim kapasitesi koşum için güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Hücre canlılığı korumanıza gerek obviating tarafından ve hücresel bariyer ortadan kaldırarak CFPS hızlı prototipleme için geleneksel olarak zorlu proteinlerin biomanufacturing ortaya çıkan uygulamalarda yanı sıra uygulamaları temel olmuştur metabolik Mühendisliği ve fonksiyonel genomik. Bir E. coliuygulamak için bizim yöntemleri-tabanlı CFPS platformu bırakmak bu uygulamaların birçoğu erişmek yeni kullanıcı. Burada, özü zenginleştirilmiş medya, şaşkın şişeler ve akort sonication tabanlı hücre lizis tekrarlanabilir yöntemi kullanılarak hazırlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Uygun reaktif stokları önceden hazırlanmış göz önüne alındığında bu özü sonra protein ifade 900 µg/mL veya daha fazla süper klasör yeşil flüoresan protein (sfGFP) veri analizi, deneysel kurulum sadece 5 h üretebilen için kullanılabilir. Reaktifler elde etme tahmini başlangıç maliyeti 4500 $ $0.021 µg üretilen protein başına veya 0.019 $ µL tepki başına tahmini ücret karşılığında tepkiler binlerce sürdürmek olduğunu. Ayrıca, protein ifade yöntemleri piyasada bulunan sistemlerde reaktif öncesi karışımları, bir kısmını maliyeti duruma getirilmesi nedeniyle görülen tepki kurulum kolaylığı ayna. Geniş uygulamaları için CFPS platform esnek doğası kaldıraç sağlamak için biz bu şekilde ayarlanmış ve kullanılabilir kaynakları ve protein ifadesi sonuçlar bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş platformu yönlerini çeşitli belirledik istenen.

Introduction

Boş hücre Protein sentezi (CFPS) protein üretim, fonksiyonel genomik, metabolik Mühendisliği ve son 50 yıl1,2içinde daha fazlası için yeni fırsatlar bir dizi kilidi bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Standart vivo içinde protein ifade platformları için karşılaştırıldığında, CFPS üç önemli avantajlar sağlar: 1) platformu boş hücre doğa olası toksik veya dış hücre3,4 olurdu proteinleri sağlar ,5,6; 2) inactivation genomik DNA’ın ve bir şablon kodlama ilgi gene(s) DNA giriş tüm protein(s) üretimi için tepki ilgi içinde sistemik enerji kanal; ve 3) platformu açık yapısı değiştirin ve gerçek zamanlı7,8kompozisyon ve reaksiyon koşulları izlemek kullanıcı sağlar. Biyolojik sistemleri genişletilmiş kimyaları ve Redoks koşullarına roman proteinleri ve metabolik süreçleri2,9, ayarlama için büyütme tepki bu doğrudan erişimi destekler 10. doğrudan erişim de daha hızlı tasarım-yapı-test11döngüleri için bir tek-pot sisteminde CFPS reaksiyon etkinlik deneyleri ile birleştirmek kullanıcı sağlar. Küçük hacimli damlacıkları CFPS reaksiyonu gerçekleştirmek veya kağıt tabanlı cihazlarda daha fazla destekler yüksek üretilen iş bulma çabaları ve hızlı prototipleme12,13,14,15 kapasite ,16. Bu avantajları ve Tak ve Kullan doğa sisteminin bir sonucu olarak, CFPS gibi solubly hızlı vivo içindeiçinzor olan proteinleri biyoteknoloji uygulamaları çeşitli benzersiz olarak sağladı17, 18,19,20, hastalık21,22,23, isteğe bağlı biomanufacturing18,24 tespiti ,25,26,27ve göstermek tüm-in hangi esneklik ve yeni boş hücre platformu eğitim28,29,.

CFPS sistemleri hem prokaryotik ve ökaryotik hücre satırlarından ham lysates çeşitli oluşturulur. Bu seçim, sistemdeki farklı seçenekler her biri avantaj ve dezavantajları bağlı olarak faiz uygulanması vardır sağlar. CFPS sistemleri de hazırlık süresi, maliyet ve verimlilik büyük ölçüde değişir. En sık özleri buğday tohumu, tavşan Retikülosit, böcek hücreleri ve Escherichia coli hücreleri, ikinci en uygun maliyetli protein30 en hacimsel verimi üreten ise bugüne varlık ile üretilen hücre kullanılan . Diğer CFPS sistemleri onların doğuştan gelen translasyonel modifikasyon makine için avantajlı olabileceği gibi E. colikullanan uygulamalar ortaya-tabanlı makine site-specifically fosforile oluşturarak boşluğu edebiliyoruz ve glikozile proteinler talep31,32,33,34,35.

CFPS reaksiyonlar ya da toplu iş iş işlemde, sürekli değişimi-boş hücre (CECF) veya sürekli akış boş hücre (CFCF) biçimleri çalıştırabilirsiniz. Kapalı bir sistem olan reaksiyon ömür boyu azalan miktarda Reaktanları ve inhibitör yan reaksiyon birikimi nedeniyle sınırlıdır Toplu biçimidir. CECF ve CFCF yöntemleri tepki ömrünü artırmak ve böylece toplu tepki göre artan hacimsel protein verimleri neden. Bu yeni Reaktanları tepki2ders boyunca sağlanan süre tepki gemiden kaldırılacak protein sentezi yan sağlayarak gerçekleştirilir. CFCF söz konusu olduğunda, faiz protein tepki odasında CECF iken, protein yarı geçirgen membran36,37oluşan reaksiyon odasında faiz kalıntılarının da kaldırılabilir. Bu yöntemler özellikle zor express proteinler faiz38,39,40,41,42yoksul hacimsel verimi üstesinden değerlidir, 43. CECF ve CFCF yaklaşımlar uygulanmasında zorluklar 1) varken Onlar transkripsiyon ve translasyon için sorumlu biyo makinelerin daha verimli kullanılmasını sonucu, toplam maliyeti ve 2 artırır reaktifler özellikle büyük miktarda gerektirir vardır) Onlar daha karmaşık reaksiyon kurulumları ve özel ekipman için toplu iş biçimi44karşılaştırıldığında gerektirir. Yeni olan kullanıcılar için erişilebilirlik sağlamak için iletişim kuralları burada toplu biçimini mililitre ölçek tepki birime artırmak için özel öneriler ile 15 µL tepki hacimleri, odak nitelendirdi.

Burada sunulan yöntemleri sigara-uzmanlar (lisans öğrencisi gibi) temel laboratuvar becerileri ile hücre büyümesini uygulamak, hazırlık ayıklamak ve biçimi tepki Kur bir E. coliiçin toplu etkinleştirmek-tabanlı CFPS sistemi. Bu yaklaşım için piyasada kitleri tepki kiti tabanlı kurulum kolaylığı ödün vermeden uygun maliyetli karşılaştırılır. Ayrıca, bu yaklaşım uygulamaları laboratuvarında ve alan sağlar. CFPS her durumda üstün olmayabilir olarak CFPS uygulamaya karar verirken, yeni kullanıcılar başlangıç yatırım için geleneksel protein ifade sistemlerinin etkinliğini iyice değerlendirmelidir. CFPS yöntem tanımlamak burada doğrudan uygulayan uygulamaları, fonksiyonel genomik, test, alanının yanı sıra vivo içinde ifade için zorlu proteinleri yüksek üretilen iş de dahil olmak üzere çeşitli sağlamak biyosensörler ve sentetik Biyoloji eğitim setleri gibi uygulamalar. Metabolik Mühendisliği gibi ek uygulamalar protein ifade koşulları, hastalık algılama ve ölçek-up kullanarak CECF veya CFCF yöntemlerini hala mümkün ancak deneyim CFPS platformu ile daha fazla tepki değiştirilmesi için gerektirebilir ayarlama koşullar. Bizim yöntemleri hücre lizis sonication, en iyi duruma getirilmiş premiksler45kullanan bir basitleştirilmiş CFPS reaksiyon Kur tarafından takip aracılığıyla nispeten hızlı ve tekrarlanabilir yöntemleri ile zenginleştirilmiş medya ve şaşkın şişe, büyüme birleştirir. Hücresel büyüme yöntemleri biraz içinde bu alan standart haline iken, hücre lizis için yöntemleri büyük ölçüde değişmektedir. Sonication ek olarak, ortak lizis yöntemleri kullanımı bir Fransız basınında, bir homogenizer, boncuk Tokmaklar, veya lizozim ve diğer biyokimyasal ve fiziksel bozulma yöntemleri46,47,48, içerir. 49. bizim yöntemleri kullanarak, yaklaşık 2 mL ham hücre ekstresinin elde edilir hücre 1 L. Hücre özü bu miktarı dört yüz destekleyebilir 15 µL CFPS reaksiyonlar, her üreten ~ 900 µg/mL muhabir sfGFP protein şablon plazmid pJL1-sfGFP. Bu yöntem maliyeti $0.021/µg, üretilen sfGFP ($.019/µL, tepki), işgücü ve ekipman (tamamlayıcı şekil 1) maliyeti hariç. Sıfırdan başlayarak, bu yöntem 4 gün içinde tek bir kişi tarafından uygulanabilir ve CFPS reaksiyonlar (şekil 1) saat içinde tamamlanabilir yineleyin. Ayrıca, protokol birimdeki kullanıcı ihtiyaçlarına uygun reaktif hazırlık daha büyük toplu işlemler için ölçeklenebilir. Önemlisi, sadece temel laboratuvar becerileri gerektirir gibi burada sunulan Protokolü eğitim laboratuvarı sigara-uzmanlar gibi lisans öğrencileri tarafından uygulanabilir. Aşağıda açıklanan işlemler ve beraberindeki video E. coli CFPS platformu için geniş kullanım erişilebilirliğini geliştirmek için özel olarak geliştirilmiştir.

Protocol

1. medya hazırlanması ve hücre büyümesi Gün 1 Bir gliserol çizgi E. coli BL21*(DE3) hücrelerden bir LB agar tabağa stok ve en az 18 h 37 ° C’de için kuluçkaya Bir sıvı döngüsü için 121 ° C’de 30 dk 50 mL LB medya ve otoklav çözüm hazırlamak Oda sıcaklığında saklayın. 2. gün 750 mL 2 x YTP medya ve 250 mL 0,4 M D-glukoz çözeltisi içinde ek bilgiler açıklandığı şekilde hazırlay…

Representative Results

Biz özü sonication tabanlı E. coli sundu dört gün span boyunca her gün üzerine yordam dökümü gösteren şekil 1 ile tamamlanabilir hazırlık protokolü. Her gün çeşitli duraklatma puan ile tamamlanabilir adımlara yumuşaklık, ama biz yürütmek en etkili olduğu için bu iş akışını bulduk. Ayrıca, hücre granül (Adım 1.3.18) ve tam olarak hazırlanan özü (Adım 2.10) en az bir yıl için kullanıcı her bir sonraki saat<stro…

Discussion

Boş hücre protein sentezi çeşitli biomanufacturing biyokimyasal sistemleri hızlı prototipleme için değişen uygulamalar için güçlü ve etkinleştirme teknolojisi olarak ortaya çıkmıştır. Uygulamalar genişliğini izlemek, yönetmek ve gerçek zamanlı olarak hücresel makine çoğaltmak için kapasite tarafından desteklenmektedir. Bu platform teknolojisi genişleyen etkisi rağmen geniş adaptasyon kalmıştır yöntemleri uygulanması teknik nüanslar nedeniyle yavaş. Bu çaba ile biz bu teknoloji yeni…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazar Dr Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher ve Tony Turretto teknik destek için Wesley Kao, Layne Williams ve Christopher Hight yararlı tartışmalar için kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca Bill ve Linda Frost Fonu, Merkezi biyoteknoloji’nın Chevron biyoteknoloji uygulanan araştırma bağış Grant, Cal Poly araştırma, Scholarly ve yaratıcı faaliyetleri hibe programı (RSCA 2017), uygulamalar için destek fon kabul ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1708919). MZL Kaliforniya Devlet Üniversitesi lisansüstü hibe eder. MCJ Ordu Araştırma Office W911NF-16-1-0372 kabul eder, Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-1413563 ve MCB-1716766, Hava Kuvvetleri araştırma laboratuvarı Merkezi mükemmellik Grant FA8650-15-2-5518, savunma tehdit azaltma ajansı hibe HDTRA1-15-10052/P00001, David ve Lucile Packard Vakfı, Camille Dreyfus öğretmen-akademik Program bölümü, enerjisi BER Grant DE-SC0018249, insan sınır bilim programı (RGP0015/2017), DOE Joint genom Enstitüsü ETOP Grant ve Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu Chicago toplum güven destek için Searle fon desteği ile.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer’s disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Tags

Escherichia ColiCell-free Protein SynthesisProtocolPlatform TechnologyFunctional GenomicsBiosensorsMetabolic EngineeringGenetic Code ExpansionCentrifugationS30 BufferDTTResuspensionAliquoting
check_url/58882?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image